论文部分内容阅读
重组的抗原肽/HLA（peptide/HLA,pHLA）复合物在研究人工抗原提呈细胞（aAPC）及T细胞特异性免疫应答中有重要用途。重组pHLA复合物的制备以基因工程及蛋白体外稀释复性技术为基础,在体外复性体系中重组HLAI类分子通过正确折叠,与抗原肽结合形成pHLA复合物。但是重组pHLA复合物的折叠复性受众多因素影响,过程复杂,折叠效率较低,因此有必要对折叠产物进行准确的分析和鉴定。相比较传统基于构象特异性抗体W6/32进行Western blot、ELISA等方法只能定性检测pHLA复合物是否形成,并不能定量检测pHLA复合物中结合的抗原肽,本研究即建立一种超滤-高效液相色谱联用技术（超滤-HPLC）定量检测重组pHLA复合物中的抗原肽,尤其针对少量制备产物中抗原肽的检测,这有助于研究HLAI分子与不同抗原肽的相互作用。同时本研究也设计β2m-HLA融合蛋白的基因结构,并进行蛋白表达与纯化。通过体外稀释复性制备重组β2m-HLA融合蛋白的pHLA复合物,比较β2m-HLA融合蛋白和β2m、HLA重链蛋白的抗原肽结合能力差异。最后利用Al（OH）3佐剂吸附上述制备的pHLA复合物和共刺激因子构建aAPCs,对人外周血淋巴细胞（PBMC）进行刺激诱导,观察CD8+T细胞的体外活化情况以及对靶细胞的特异性杀伤作用。主要内容及结果如下:一、HLA-A*2402重链蛋白,β2m及β2m-HLA*2402融合蛋白的表达与纯化本部分对HLA-A*2402基因进行改造,去掉信号肽、跨膜段和胞内段编码序列,在下游接上生物素化序列（BSP）基因;另外通过蛋白柔性接头将β2m与改造后的重链蛋白连接融合,设计构建β2m-HLA融合蛋白。选用pET-28a质粒与改造后的HLA-A*2402重链基因,β2m基因,β2m-HLA-A*2402融合蛋白基因进行重组,构建三种重组质粒:pET-28a-HLA-A*2402、pET-28a-β2m、pET-28a-β2m-HLA-A*2402。将重组质粒分别转化宿主菌BL21（DE3）,经IPTG的诱导后高效表达三组蛋白,提取包涵体经纯化后溶于高浓度尿素溶液中,为下一步制备pHLA复合物的研究工作提供了材料来源。二、pHLA复合物的制备及超滤-HPLC联用技术检测在HLA-A*2402限制性gp100蛋白的抗原肽VYFFLPDHL（简称VYF抗原肽）存在条件下,HLA-A*2402重链蛋白,β2m通过稀释复性制备VYF/HLA-A*2402复合物。本部分初步建立一种超滤-HPLC联用技术,用于定量检测重组pHLA复合物中的抗原肽。具体技术路线:复性产物经超滤处理,先除去未被HLA I类分子结合的游离抗原肽而保留复合物,将超滤管上部复性产物经酸处理,pHLA复合物的三个组分之间相互作用被破坏从而释放抗原肽,再次超滤收集释放抗原肽并进行HPLC检测。应用此技术和Western blot法分别对pHLA复性产物进行检测鉴定,结果均显示复性产物中存在具有天然构象的pHLA复合物。另外β2m-HLA-A*2402融合蛋白与其限制性抗原肽共复性产物的超滤-HPLC检测结果显示β2m-HLA-A*2402融合蛋白与其限制性抗原肽共复性,可获得具有天然构象的pHLA复合物,且其复性效率显著高于HLA-A*2402重链蛋白、β2m的复性效率。三、VYF/HLA-A*2402-aAPC的构建及VYF特异性CTL活化研究为了进一步研究制备的VYF/HLA-A*2402复合物的生物学功能,比较VYF/β2m-HLA-A*2402融合蛋白pHLA复合物与非融合蛋白pHLA复合物对CD8+T细胞活化的影响。本部分利用Al（OH）3佐剂吸附VYF/HLA-A*2402复合物及抗CD28抗体分子构建aAPC,刺激HLA-A*2402阳性健康个体PBMC,诱导VYF特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）的生成。通过四聚体免疫荧光标记及细胞毒实验,鉴定诱导CTL的特异性。结果显示,两种pHLA复合物分别和抗CD28抗体分子共同吸附构建的aAPC均能有效诱导VYF特异性CTL的生成。综上所述,在VYF抗原肽存在条件下,本研究构建的β2m-HLA-A*2402融合蛋白通过体外稀释复性可获得具有天然构象的VYF/HLA-A*2402复合物,构建的以Al（OH）3佐剂为载体的VYF/HLA-A*2402-aAPC能有效诱导抗原肽特异性CTL生成。另外本研究所构建的超滤-HPLC联用技术可通过定量检测pHLA复合物中的抗原肽,进一步分析pHLA复合物的制备率,可对pHLA复合物制备过程进行质量控制。