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大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病隶属于马铃薯Y病毒属,是影响大豆产量和品质的病毒病害之一,在全球各大豆产区均有发生。了解影响SMV流行的相关因素,可以有效预防病害的发生和发展;而控制病害传播的关键则是培育抗病品种,了解抗病信号途径以及相关基因的作用机理,为大豆抗病育种奠定基础。本研究通过对50份材料接种黄淮海和长江流域流行株系SC3和SC7株系,筛选具有种粒斑驳和种传抗性的材料,为大豆种粒斑驳和种传抗性的研究提供候选种质资源;利用SC3和SC7以及两个感病大豆品种,在四种不同的大豆花叶病毒初始种传率条件下,研究SMV在自然环境条件下的病害传播情况、影响病害传播的主要因素以及对大豆生产的影响,为研究SMV的防控、减少其对大豆产量和品质的影响提供依据。为了研究大豆感病后SMV在植株体内的运动和分布情况,比较大豆不同部位叶片的病毒相对含量,检测满粒期和完熟期的种子各部位病毒携带情况,以及病毒的种传率,旨在了解病毒的种传机制;而病毒表达载体可以更方便的研究病毒的运动、无毒基因和致病因子。另外通过基因组序列分析、基因诱导表达、QTL、eQTL定位等多种方式相结合,评价SA信号途径相关基因RDR和NPR家族在大豆抗SMV育种中的应用价值。主要研究结果如下:1.籽粒斑驳和种传抗性品种的鉴定50份大豆品种(品系)在V3期接种黄淮海和长江流域SMV流行株系SC3和SC7,收获感病植株的种子测定斑驳率和种传率。结果显示接种SC3后的籽粒平均斑驳率为44.98%,与接种SC7后的斑驳率(49.42%)有显著差异(p<0.05)。接种SC3后植株的病情指数与斑驳率无显著相关(p>0.05),接种SC7后的病情指数与斑驳率极显著相关(p<0.01)。其中,A3、SD1112和SD1108三份材料对SC3和SC7株系均具有种粒斑驳抗性。感染SC3株系的大豆品种平均种传率为1.47%,感染SC7株系的为1.22%,二者差异不显著。种传率鉴定结果还表明种皮斑驳与病毒种传没有直接关系,种皮斑驳并不是病毒种传的标志。研究发现农丰12、A1、南农307-1、道秋1号等对SC3和SC7株系均具有较好的种传抗性。A3、SD1112和SD1108三份材料对SC3和SC7株系不仅具有种粒斑驳抗性,还具有种传抗性,这些品种可为研究籽粒抗性遗传机制以及抗病育种提供抗源。2.影响SMV传播的相关因素为研究影响SMV横向传播的主要因素,利用SC3和SC7株系以及两个感病大豆品种南农菜豆5号和南农86-4,四种不同的SMV初始种传率,研究2009年和2010年大田种植情况下SMV的的发生情况。结果表明:年份、品种、株系以及初始种传率对病害传播均有显著影响。接种SC3株系发病率高于SC7;温度偏低有利于病害的发生和发展;南农菜豆5号发病率显著大于南农86-4;初始种传率越高,大豆田间发病率也越高。这些结果说明影响病害传播的因素较多,增加了控制病害的难度。田间试验表明接种SC3株系发病率高于SC7株系,克隆并测定CP和HC-Pro基因序列。SC3和SC7株系的CP基因在碱基水平有95.09%的相似性,蛋白水平有98.83%的相似性;HC-Pro基因在碱基和蛋白水平分别有99.71%和99.54%的相似性。其中,SC3株系CP蛋白N末端蚜传相关序列为DAG序列,SC7株系为DAD序列;SC3和SC7株系HC-Pro蛋白蚜传所必须的KITC均被KLSC替代,PTK序列没有变化。推测两个株系田间传播效率不同的主要原因可能是CP蛋白蚜传序列的不同。南农菜豆5号和南农86-4不同时期感染SMV后,在株高、单株粒重和斑驳率上均有显著差异,发病越早对植株影响越大。大豆生长后期(R3)感染SMV与健康植株株高、单株粒重上没有显著差异,而在斑驳率上差异显著。3.SMV在大豆体内的运动和分布在大豆V4期接种SC7株系后的qRT-PCR分析显示,新生叶片病毒含量显著高于老叶片;ELISA检测发现第四片复叶形态学上方和下方的花、籽粒和果皮的病毒携带率均高于80%。结果说明大豆4节期感病后,SMV从侵染点向形态学上方或下方的运动在新生组织中没有明显差异。将满粒期(R6)的籽粒和完熟期的种子分为种皮、子叶和胚三部分。ELISA检测结果表明满粒期种子中,病毒主要位于种皮,病毒携带率高达98.04%,子叶和胚中分布较少;南农86-4种子三部分均发现病毒,而南农菜豆5号的胚中未发现阳性样本。与满粒期种子相比,南农86-4和南农菜豆5号完熟期的种子种皮病毒携带率分别从98.04%和94.64%降低至7.55%和18.03%;南农86-4的种皮、子叶和胚中均发现了病毒,南农菜豆5号仅在种皮中检测到病毒。种传率鉴定结果显示南农86-4的种传率为1.62%,带毒种子长出的感病植株长势弱于健康植株,在真叶期或第一片复叶期就会显示可见的SMV症状,它成为田间SMV流行的病毒来源,借助介体蚜虫在田间扩散。南农86-4种子表面消毒或者去皮后依然有种传感病植株,结果表明种皮的表面处理不能有效去除种子内部的病毒,SMV病毒依然可以种传。而南农菜豆5号没有发现种传感病植株。为了观察病毒在植物体内的运动,构建含有SC15株系的病毒表达载体pSC15,它能侵染大豆并出现典型症状。携带GFP的病毒表达载体pGFP,虽然能够在叶片中观察到绿色荧光,但是此载体在南农1138-2叶片的症状表型和CP蛋白表达上均比较弱。4.RDR及NPR家族在抗SMV中的应用价值本研究比较了科丰1号和南农1138-2健康植株SA(水杨酸)含量,科丰1号为235.3±11.8 ng/g.Fw,是南农1138-2中含量的两倍;说明未接种SMV的时候,科丰1号的SA代谢强度就相对较高。接种SMV 1 h后,科丰1号的SA含量就达到524.6±16.7 ng/g.Fw,达到本次试验的最高值,然后逐渐回落。而南农1138-2的SA含量在接种24小时后达到最高值,为317.8±27.7 ng/g.Fw。这说明科丰1号叶片SA含量在处理前后都高于南农1138-2,并且对SMV的响应更迅速。通过比较Gm02g09470(NPR)和Gm19g31180(RDR)在接种SMV和喷施SA后7个时间点的的表达量,发现它们的表达量总体是上升的。其中RDR基因在科丰1号中响应迅速,并且表达量高于南农1138-2。科丰1号接种SMV或者喷施SA后NPR基因表达量前四个时间段有所上升;而南农1138-2接种SMV或者喷洒SA后,前三个时间段表达量呈下降趋势,该基因表达模式在抗感品种间存在差异。利用Windows QTL Cartographer软件对SC7和SC13株系在科丰1号×南农1138-2 RIL群体中的发病率以及Gm02g09470(NPR)和Gm19g31180(RDR)基因在RIL群体中的表达量进行连锁分析,定位到多个数量性状遗传位点。Gm02g09470(NPR)的表达量定位到D1b(2号染色体)上的四个eQTL位点;Gm19g31180(RDR)的表达定位到F(13号染色体)和E(15号染色体)连锁群的五个eQTL位点。对SC7的抗病位点定位到D1b连锁群上Gm02sv065附近以及其他染色体上的三个位点;SC13定位到D1b连锁群上的scaffold608.2386089和Gm02sv068附近,与SC7在该连锁群上的区域重合;另外SC13还定位到D1a的scaffold1410.765801标记附近。对D1b连锁群分析后,我们认为2号染色体上的52 cM和57 cM附近两个位点是SMV的重要抗性位点。