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耶尔森氏菌通过三型分泌系统(Type three secretion system,T3SS)将其产生的毒力效应蛋白Yops直接注入到宿主细胞,干扰宿主的天然免疫,使细菌得以在宿主细胞中存活。耶尔森氏菌的T3SS由pYV毒力质粒编码,当耶尔森氏菌与宿主细胞接触或在体外37℃低钙条件下Yops被诱导大量表达分泌。除T3SS自身具有的调控机制外,也有少数基因组编码的调控因子对其具有调控作用。T3SS调控机制的研究是目前研究的热点,对T3SS的调控机制研究将为新的抗生素的研究提供新的靶标。本研究以假结核耶尔森氏菌YpⅢ为模型,研究了葡萄糖等PTS糖类抑制Yops蛋白分泌的机制,证明Crp介导的PlcrGVH-yopBD启动子的转录抑制效应在其中发挥了关键作用,并提出了一种新的T3SS的调控方式。主要包括以下三方面的结果:
1.葡萄糖可以在细菌胞内抑制Yops分泌。在YpⅢ培养基中添加葡萄糖、果糖、甘露糖及N-乙酰葡糖胺均可抑制Yops蛋白分泌,而添加其它糖不能发挥作用。这四种具有调控作用的糖均通过PTS转运进入细菌胞内,当PTS系统组分缺失后,这四种糖则失去其调控作用,说明PTS糖需要转运到细菌胞内才能够发挥其调控作用。
2.葡萄糖通过调控Crp(cAMPreceptor protein)蛋白的功能抑制Yops分泌。Crp缺失,葡萄糖抑制Yops分泌的功能消失。Crp蛋白表达水平检测显示葡萄糖对Crp蛋白的表达无明显影响,且过表达Crp不影响Yops分泌,说明葡萄糖通过影响Crp的调控功能发挥作用。葡萄糖以葡萄糖-6-磷酸转运进细菌胞内后,在磷酸葡萄糖异构酶(Pgi)的作用下,进入糖酵解途径进行代谢。Pgi基因缺失后,葡萄糖对Yops分泌的抑制作用得以解除,推测糖酵解过程参与Crp对Yops分泌的调控。
3.Crp蛋白通过直接抑制PlcrGVH-yopBD(P58)启动子活性抑制Yops分泌。比较添加及不添加葡萄糖的条件下YpⅢ野生型pYV质粒上所有基因的启动子活性,发现葡萄糖对P2,P40,P58启动子活性的抑制最为明显,且这种抑制作用在crp基因突变后得以解除。P2与P40中调控蛋白的缺失对Yops分泌无影响,而在P58突变体中Yops蛋白不能分泌;在E.cob中对Crp-P58相互作用检测也显示Crp对P58具有直接的调控作用。说明葡萄糖可以通过Crp抑制PlcrGVH-yopBD的启动子活性来抑制Yops蛋白分泌。