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黑莓(Rubusspp.)是应用于园艺栽培生产的蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)植物之一,因果实成熟过程中经历绿色、红色的变化,最后花青素苷(Anthocyanin)大量积累出现深红色接近黑色而得名。黑莓果实中类黄酮物质含量丰富,包括酚酸、原花青素(Proanthocyanidin,PA,也称缩合单宁)和花青素苷等。其中原花青素在幼果中的含量可以超过40 mg/g鲜重(Fresh weight,FW),但随着果实的成熟迅速减少,并且花青素苷逐渐积累;而黑莓果实的花青苷主要是矢车菊素-3-O-葡糖糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside,Cy3G),含量超过 1.76mg/gFW;TT12 定位于液泡膜上,是多药和有毒化合物排出家族(Multidrug and Toxic Compound Extrusion,MATE)成员之一,能特异地转运矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。同时,编码该蛋白的基因的突变能导致原花青素积累功能丧失。因此以富含花青素和原花青素的黑莓为试验材料研究TT12基因的功能,可以为利用基因工程技术对黑莓现有种质进行遗传改良提供参考依据。本研究根据已登录的黑莓转录组数据,结合GenBank数据库中已登陆的草莓、苹果、碧桃等TT12同源基因设计引物,分离出RuTT12-1基因的全长,并对其进行生物信息学分析。构建原核表达载体在大肠杆菌中对RuTT12-1进行诱导表达。构建过表达载体对RuTT12-1进行功能分析。主要结果如下:(1)通过同源基因克隆的方法从黑莓果实中获得了一个TT12基因的全长cDNA,命名为RuTT12-1(Genbank登录号:KX130853)。该序列长1659bp,包含一个1464 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码487个氨基酸,推断其编码的蛋白的相对分子量(Molecular Weight,MW)为53.09 kDa,等电点(PI)为5.416,具有典型的MATE家族保守结构域;跨膜结构预测显示,该蛋白含有十二个跨膜结构域。(2)氨基酸序列比对结果显示,RuTT12-1与多个物种TT12基因编码的蛋白具有较高的同源性,说明TT12基因在进化过程中较为保守。系统进化树表明RuTT12-1与森林草莓FvTT12具有最高的同源性,达到87%。(3)密码子偏好性分析显示,RuTT12-1基因表达量不高,偏好使用以A/T结尾的密码子,且7种最优密码子也均以A/T结尾。在密码子的使用频率上,RuTT12-1基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotianatobacum)的差异小于和玉米(Zeamays)、小麦(Triticum aestivum)的差异,因此拟南芥和烟草更适合作为该基因的异源表达宿主。通过与35种植物TT12基因密码子偏好系数对比分析,大部分TT12基因偏爱使用以A/T结尾的密码子,这可能与其功能有关。(4)成功构建了 原核表达载体 pET-32a(+)-RuTT12-1 及 pEASY-Blunt E1-RuTT12-1,在大肠杆菌中采用不同IPTG浓度、不同诱导时间、不同诱导温度条件下诱导RuTT12-1基因的表达,但均未能获得理想的结果,可能是由于RuTT12-1跨膜蛋白的疏水性结构过多,导致其在大肠杆菌中无法表达或表达过弱。成功构建了过表达载体pCAMBIA1301+-RuTT12-1。通过农杆菌介导的浸花法转化pCAMBIA1301+-RuTT12-1重组质粒到哥伦比亚野生型拟南芥中,使用潮霉素筛选出2株转入目的基因的阳性植株。与野生型拟南芥相比,转目的基因拟南芥植株中花青素含量增加,原花青素含量降低,认为黑莓RuTT12-1基因参与了花青素与原花青素的转运。