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研究背景:组蛋白乙酰化调节细胞的多种生理功能,参与染色质结构重建,在表观遗传调控中占有重要地位。组蛋白的乙酰化与去乙酰化过程由功能相互拮抗的组蛋白乙酰化酶(Histone Acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)共同调控。目前,哺乳动物体内已发现18种HDAC亚型,在细胞的生命历程中发挥着重要作用,与肿瘤、艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)等疾病的发生发展密切相关。高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Anti-Retroviral Therapy,HAART)是目前AIDS临床治疗的主要方法,但HARRT只能清除血液中的病毒,却无法清除体内存在的病毒潜伏库(Reservoir)。通过药物激活潜伏病毒以彻底清除HIV,是目前AIDS治疗研究的热点和难点。目前发现的基于HDAC抑制剂(HDAC inhibitor,HDACi)的潜伏病毒活化剂有丙戊酸(Valproic acid,VPA)、伏立诺他(Suberoylanilidehydroxamicacid,SAHA)、曲古抑菌素 A(TrichostatinA,TSA)等,能有效激活HIV的表达。在我国,中药和中药复方被广泛应用于AIDS的治疗和辅助治疗。对天然来源的小分子化合物进行HDAC抑制活性筛选,有可能发现具有活化潜伏HIV-1、促进病毒库清除的高效HDACi。研究目的:本课题组前期发现广州中医药大学热带医学研究所研发的用于治疗HIV/AIDS的中药复方艾可清2号具有HDAC抑制活性。本研究的目的在于通过对属于艾可清2号组方中药的单体成分进行HDAC抑制活性评价,以确定艾可清2号中抑制HDAC的活性成分。同时对其他来源的中药单体成分也进行了 HDAC抑制活性筛选,以期发现高效的HDAC抑制剂。研究方法:1.采用HDAC抑制剂筛选试剂盒对艾可清2号含有的59个化合物(其中17个成分在口服艾可清2号后可在血中检出)、从箭叶淫羊藿中分离到的12个黄酮苷类化合物、以及其他中药来源的83个化合物进行HDAC抑制活性筛选;2.对前期筛选出HDAC抑制活性较好的化合物,采用HDAC3/8抑制剂筛选试剂盒对其HDAC3/8抑制活性作进一步评价;3.选择HDAC抑制活性较好的十个单体化合物,以人宫颈癌细胞HeLa为模型,Western Blot法检测药物作用24h是否影响细胞内HDAC蛋白的表达。研究结果:1.采用HDAC抑制剂筛选试剂盒对154个不同来源的化合物进行HDAC抑制活性筛选,结果发现在100μM浓度时,(1)艾可清2号含有的单体成分中以异甘草素(艾可清2号口服入血成分)和丹酚酸C对HDAC活性的抑制效果最好,抑制率分别为52.7%和51.0%;其他来源的73个化合物中以血根碱(博落回来源)和胡椒碱(胡椒来源)抑制效果最好,抑制率都为53.1%;其余化合物对HDAC活性抑制作用较弱(抑制率<50%)或未检测到抑制活性。(2)箭叶淫羊藿黄酮苷成分中有3个显示了一定的HDAC抑制活性,但抑制率不强(20%<抑制率<50%),分别为山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(38.7%),山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷(31.3%),山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(26.5%)。2.采用HDAC3/8抑制剂筛选试剂盒对十一个化合物进行了 HDAC3/8抑制活性评价。这些化合物分别是异甘草素、异甘草苷、丹酚酸A、丹酚酸C(艾可清2号来源),血根碱、胡椒碱、姜黄素、异槲皮苷(其他来源),山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷和山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(箭叶淫羊藿来源)。结果发现在100μM浓度时,(1)艾可清2号的口服入血成分异甘草苷和异甘草素对HDAC3活性抑制作用最强,抑制率分别为99.5%和98.3%。异甘草苷和异甘草素对HDAC8活性的抑制作用也最强,抑制率分别为63.0%,68.6%。(2)异槲皮苷和血根碱对HDAC3的抑制率分别为76.0%和56.4%,对HDAC8的抑制率分别为47.3%和46.2%;(3)山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷和山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷也表现出了较强的HDAC3抑制活性,抑制率分别为77.8%、60.6%和53.2%;但它们对HDAC8的抑制率都小于50%。(4)丹酚酸A对HDAC3和HDAC8的抑制率分别为43.5%和52.7%。(5)胡椒碱、丹酚酸C和姜黄素未检测到对HDAC3/8有明显抑制作用。3.Western Blot法检测了十个筛选出的化合物在其无/低细胞毒性浓度下作用24h,对 HeLa细胞内 Ⅰ 类(HDAC1～3 和 HDAC8),Ⅱ 类(HDAC4～7和HDAC9、10)和Ⅳ类HDAC(HDAC11)表达的影响。这些化合物分别是:艾可清2号成分异甘草素、异甘草苷、丹酚酸A和丹酚酸C;其他来源成分血根碱、胡椒碱和异槲皮苷;箭叶淫羊藿成分山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷和山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。结果发现,(1)异甘草素(25、50μM)能剂量依赖性减少HDAC4、HDAC7、HDAC10的表达,一定程度减少HDAC3、HDAC8,HDAC11的表达;异甘草苷(50、100μM)能明显减少 HDAC3 和 HDAC5、HDAC7、HDAC9、HDAC10,HDAC11 的表达。(2)丹酚酸A(50、100μM)能剂量依赖性减少HDAC3、HDAC8、HDAC4、HDAC6、HDAC7、HDAC9、HDAC10 和 HDAC11 的表达;丹酚酸 C(50、100μM)能在一定程度上减少HDAC5、HDAC10和HDAC11的表达。(3)血根碱(3、4μM)能剂量依赖性抑制HDAC1、HDAC3、HDAC8(Ⅰ类),HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9(Ⅱ类)的表达。(4)胡椒碱(100μM)能减少HDAC6和HDAC11的表达。(5)异槲皮苷(100μM)能明显减少HDAC8,HDAC11的表达。(6)山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷和山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(50、100μM)能明显抑制HDAC6、HDAC10的表达;山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷能抑制HDAC7,HDAC11的表达,在100μM时能一定程度抑制 HDAC4,HDAC5 和 HDAC9 的表达。结论:1.本研究发现艾可清2号口服入血成分异甘草素和异甘草苷既能显著抑制HDAC3/8活性,还能显著抑制HeLa细胞中HDAC蛋白的表达。异甘草素和异甘草苷应属于艾可清2号的有效成分,并可能在体内通过抑制HDAC活性发挥作用。这两个化合物是否能激活潜伏HIV还需要进行研究。2.本研究同时还发现艾可清2号组方成分丹酚酸A和丹酚酸C(口服尚未在血中检出),箭叶淫羊藿中的黄酮苷化合物,以及其他来源的单体成分血根碱等对HDAC蛋白的活性及蛋白的表达也都具有良好的抑制作用。值得进一步研究。