肠道微生物对宿主营养物质的消化吸收、肠道健康及功能具有重要作用。日粮是影响肠道微生物最主要的因素之一,近年来营养素与肠道微生物之间的互作成为研究热点。为了缓解我国蛋白质资源紧缺,在猪养殖中采用低蛋白氨基酸平衡日粮能提高氮营养素利用率,减少氮污染物排放。但日粮蛋白水平和氮营养素形式对肠道微生物和微生物代谢的影响还有待进一步研究。大肠微生物由于数量巨大、种类繁多,是维持机体肠道微生物稳态最主要的组成部分,建立大肠微生物干预模型有利于深入研究其对宿主营养、代谢和肠道功能的作用。本研究以猪为研究对象,首先研究蛋白质水平和氮营养素形式对肠道微生物及代谢产物的影响,然后建立了抗生素干预大肠微生物模型,研究大肠微生物对宿主氮营养素消化、吸收和宿主代谢的影响,并探讨了肠道微生物及其代谢的改变对肠道发育和蠕动功能的影响。1低蛋白必需氨基酸平衡日粮对生长猪肠道微生物及其代谢产物的影响试验选取40头杜长大阉公猪(日龄45±2天,初始体重13.50±0.50 kg),随机分为4组,每组10个重复,每个重复1头猪。分别饲喂20.00%(NP)、17.16%(MP)、15.30%(LP)和13.90%(ELP)粗蛋白日粮,平衡必需氨基酸使其满足NRC(2012)营养需求,试验期28天。试验结束选取体重接近平均体重的仔猪8头屠宰,采集回肠、盲肠、结肠食糜和黏膜组织,分析菌群结构和代谢产物。结果显示:较NP和ELP组,适当降低日粮粗蛋白显著增加了(P<0.05)LP组结肠食糜,MP和LP组结肠黏膜的菌群多样性指数。回肠、盲肠和结肠食糜中Bifidobacterium数量随日粮水平降低呈显著线性下降(Linear,P<0.05),ELP组盲肠和结肠食糜中Bifidobacterium的数量显著低于(P<0.05)NP和MP组,但ELP组结肠食糜中E.coli数量则显著高于(P<0.05)LP组。随日粮蛋白水平下降,回肠食糜中总短链脂肪酸(T-SCFA)、乙酸和丁酸浓度线性增加(Linear,P<0.05),而盲肠中所有短链脂肪酸(除甲酸外),结肠食糜中T-SCFA和乙酸浓度线性降低(Linear,P<0.05)。降低蛋白水平导致回肠、盲肠和结肠食糜中微生物蛋白(MCP)和氨氮浓度均线性降低(Linear,P<0.05),但盲肠食糜中亚精胺,结肠食糜中总生物胺、腐胺、甲胺和亚精胺浓度则呈现出先升高后降低的二次项变化规律(Quadratic,P<0.05),且LP组浓度最高。结果表明,适度降低日粮粗蛋白水平(降至15.30%)能提高大肠内菌群多样性,但更大程度的降低蛋白水平则可能对微生物结构和发酵产生不利影响。2低蛋白日粮补充不同形式氮营养素对生长猪结肠微生物、微生物代谢产物及肠道发育基因表达的影响试验选用80头杜长大阉公猪(初重15.57±0.13 kg,日龄48±2天),随机分为4组。每组5个重复,每个重复4头猪。分别饲喂粗蛋白为17.00%(MP)、15.00%(LP)、13.00%+AA(ELP-AA)和 13.90%+酪蛋白(ELP-CAS)的日粮。MP、LP和ELP-AA组日粮平衡所有AA,ELP-CAS组日粮中添加3%酪蛋白,均使其满足NRC(2012)中15-25kg猪AA需求,试验期28天。试验结束后每栏挑选1头接近栏平均体重的仔猪屠宰,采集结肠食糜和组织,分析食糜中营养物质浓度、微生物数量和微生物代谢产物,肠道组织中发育相关基因表达。结果显示ELP-AA和ELP-CAS组结肠食糜中粗蛋白含量显著低于(P<0.05)MP和LP组,而葡萄糖含量显著高于(P<0.05)MP和LP组。ELP-CAS组总糖和支链淀粉含量显著低于(P<0.05)MP和 LP 组。ELP-AA 组 Firmicutes、Bacteroidetes、Bacteroides、Prevotella数量显著低于(P<0.05)MP 组,Lachnospiraceae、Roseburia和Bifidobacterium数量显著低于(P<0.05)其他三组,而ELP-CAS则与MP组无显著差异。ELP-CAS组较MP组显著降低了(P<0.05)Clostridium cluster ⅣV 群,Peptostreptococcus数量显著低于(P<0.05)其他三组。对于细菌代谢产物,ELP-AA和ELP-CAS组较MP和LP组显著降低了(P<0.05)结肠中总短链脂肪酸(T-SCFA)和乙酸浓度,较MP组显著降低丁酸浓度(P<0.05),但ELP-CAS组甲酸浓度显著高于其他三组(P<0.05),氨氮和微生物蛋白浓度(MCP)浓度显著高于(P<0.05)MP和LP组。ELP-AA和ELP-CAS组总生物胺浓度显著升高(P<0.05),其中尸胺浓度较MP和LP组显著增加(P<0.05),而亚精胺和组胺浓度较LP组显著降低(P<0.05)。对于肠道组织中发育相关基因的表达,ELP-CAS 组 GLP-2、EGF、βFGF、βFGF-rI基因表达均较 LP 和 ELP-AA 显著增加。研究结果表明,日粮粗蛋白从17.00%降至13.00%补充AA或酪蛋白均导致结肠中碳水化合物、碳水化合物发酵菌和SCFA的降低。极低蛋白日粮中补充酪蛋白能改善大肠中部分菌群数量并促进肠道发育基因表达,但增加了微生物蛋白合成、氨氮和生物胺浓度。3回肠末端灌注抗生素对猪全肠道微生物结构的影响试验选用14头杜长大阉公猪(初重12.08±0.28 kg,日龄45天),手术安装回肠末端T型瘘管,术后恢复10天,并随机分为2组,每组7头猪。试验组从瘘管灌注复合抗生素(ANT组,氨辛西林150mg/kg/d,庆大霉素4mg/kg/d,甲硝唑30mg/kg/d,溶于10ml无菌生理盐水),对照组每天灌注相同体积无菌生理盐水(CON组)。试验期25天,试验期间每组各1头因健康不佳被淘汰,饲养试验结束每组屠宰6头猪,采集胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠食糜和黏膜,利用高通量测序分析了全肠道微生物结构,利用Real-time PCR技术分析空肠和结肠食糜中微生物数量。结果显示:回肠末端灌注抗生素显著(P<0.05)改变了大肠食糜和黏膜中的微生物结构,盲肠、结肠食糜和结肠黏膜中OTU数量、Ace和Chao1指数显著降低(P<0.05),但显著增加了(P<0.05)胃黏膜的微生物丰富度和多样性指数。属水平上,抗生素干预对前肠微生物影响较少,主要增加了Streptococcus的相对丰度。回肠末端灌注抗生素显著减少了(P<0.05)大肠中SCFA产生菌的相对丰度,如Ruminococcaceae、Clostridiales、Coprococcus、Campylobacter、Clostridium、Prevotella和Bacteroides等;增加了(P<0.05)大肠中乳酸产生菌和条件致病菌的相对丰度,如Lactobacillus、Stuterella和Collinsella等。对空肠和结肠食糜中的主要微生物进行定量,结果也显示回肠末端灌注抗生素显著降低了(P<0.05)结肠中 SCFA产生菌数量,如 Clostridium cluster XⅣVa、Roseburia、Ruminococcus和 Lachnospiraceae 等,但增加了乳酸产生菌数量,如 Enterococcus和Lactobacillus。由此说明,回肠末端灌注抗生素主要干预了大肠食糜和黏膜微生物的组成,对前肠微生物影响较小,此模型是研究大肠微生物影响机体代谢的一种有效手段。大肠中短链脂肪酸产生菌的减少和潜在病原菌的增加可能不利于猪的肠道发育和健康。4抗生素干预大肠微生物对猪生长、消化和代谢的影响在前一章动物试验基础上研究抗生素干预大肠微生物对猪生长、消化和代谢的影响。试验期每5天称取体重,每天记录采食量和猪健康状况,计算猪生产性能。试验第26天屠宰,计算屠宰性能并称取器官重量,测量肠道重量和长度;采集血液样品测定血液生理生化和血清激素;采集回肠和结肠食糜用于营养物质消化率分析;采集胃食糜、空肠食糜和胰腺组织分析消化酶活性。结果显示:回肠末端灌注抗生素干预猪大肠微生物对猪体增重和器官重均无显著影响,但降低了小肠(P<0.05)和大肠(P<0.10)的相对重量,显著增加了(P<0.05)大肠食糜重量。对于血液生理生化指标,抗生素干预显著降低了(P<0.05)血清总蛋白、白蛋白、低密度脂蛋白和总胆汁酸浓度,并显著增加了(P<0.05)血清葡萄糖水平和谷草转氨酶活性。与对照组相比较,抗生素组血清中胰岛素、GLP-1、胃泌素和PYY浓度升高。抗生素干预显著增加了粪氮的排放,因此降低了氮的表观利用率。虽然抗生素干预显著增加了(P<0.05)空肠糜蛋白酶活力和胰淀粉酶活力,但对回肠营养物质消化率无显著影响。抗生素干预显著降低了(P<0.05)结肠有机物、粗蛋白、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维以及所有AA(除Arg和Tyr)的消化率,增加了(P<0.10)粗脂肪的消化率。结果表明,猪大肠微生物的改变对猪生长性能和器官发育无显著影响,但可能通过改变大肠营养物质消化率和肠道激素分泌影响机体代谢和肠道发育。5抗生素干预大肠微生物对猪肠道发育及蠕动功能的影响在前两章基础上深入研究大肠中微生物代谢产物变化及干预肠道微生物对肠道发育和蠕动功能的影响。结果显示:抗生素干预显著增加了(P<0.05)回肠末端食糜流量和食糜在盲肠中滞留时间,降低了结肠肠壁肌肉层厚度下降(P=0.087),显著下调了(P<0.05)结肠组织中IGF-1和IGF-1受体的基因表达。分析全肠道微生物代谢产物发现,前肠中微生物代谢产物受抗生素影响较少,抗生素干预显著降低了(P<0.05)盲肠和结肠中SCFA和粪臭素浓度及结肠中氨氮浓度,并增加了(P<0.05)结肠中甲酸、乳酸和生物胺(P胺、色胺和精胺)浓度。对血清和肠道组织调节肠道蠕动的神经递质和激素分析发现,抗生素显著提高了(P<0.05)血清中5-HT、GLP-1和PYY的浓度,其中采食后4h血清中5-HT浓度和采食后8h血清中GLP-1较对照组显著上升(P<0.05)。回肠组织中,抗生素干预对激素和调节激素的基因表达均无显著影响,但显著提高了(P<0.05)结肠组织中5-HT、GLP-1和PYY的浓度,上调了(P<0.05)结肠组织中Tph1、GLP-1和PYY的基因表达,同时5-HT受体基因5HT2A和5HT1B基因表达量也显著提高(P<0.05)。以上结果表明,抗生素抑制大肠中SCFA产生,阻碍了大肠肌肉层的发育,减缓了肠道蠕动。肠道组织和血清中5-HT和促肠道蠕动激素GLP-1、PYY的mRNA表达和浓度增加,引起回肠末端食糜流速加快,延长了大肠中食糜滞留时间。大肠中乳酸和生物胺浓度增加,可能不利于肠道的健康。综上所述,日粮蛋白水平主要影响了猪大肠中微生物结构,极低蛋白日粮造成大肠中微生物多样性下降,有益菌减少,有害菌增加,SCFA产生减少等不利影响。在极低蛋白日粮中补充酪蛋白能部分改善SCFA产生菌数量,增加乙酸产生,促进肠道发育基因表达,但微生物对蛋白质利用和发酵增加不利于宿主对蛋白质的吸收和肠道健康。通过大肠微生物干预模型研究显示大肠微生物通过调节营养物质消化和肠道激素分泌影响宿主的代谢和肠道发育。大肠中SCFA产生菌的减少,导致肠道蠕动减缓、乳酸堆积和蛋白质发酵产生的生物胺增加可能是影响肠道健康的原因之一。