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白念珠菌{Candida albicans)是念珠菌病原体中最常见的条件性致病菌,也是医院获得性真菌病的主要感染源之一。铁离子获得能力是白念珠菌在宿主中定居、存活和致病过程中的重要影响因素。多铜氧化酶(multicopper oxidase, MCO)基因是白念珠菌高亲和性铁获得系统的关键组分。白念珠菌基因组中含有5个MCO编码基因,研究这些基因的功能和表达调控关系,将有助于深入地了解白念珠菌在低铁环境中的存活机制,为今后白念珠菌的感染治疗和药物开发提供重要的理论依据。首先通过荧光定量PCR方法分析了铁、铜离子对白念珠菌MCO基因的调控作用,结果发现：CaFET3、CaFET34和CaFET99是白念珠菌应答低铁条件的主要MCO基因；低铜条件只是对部分MCO基因的表达产生轻微影响。而当铁铜同时缺乏时,所有MCO基因的表达均会明显升高,表明铁铜离子对MCO基因的表达具有重要的调控作用。为了进一步研究MCO基因在铁代谢方面的作用,构建了白念珠菌CaFET33和CaFET34基因酿酒酵母回补菌株,发现CaFET34可以有效地回补Scfet3△在低铁条件下的缺陷表型。利用PCR介导的同源重组方法进一步构建了Cafet33△/△和Cafet34△/△缺失菌株,测定了其胞内铁含量和铁吸收能力的变化。结果表明在缺铁条件下,CaFET34的缺失会明显降低细胞的铁含量和铁吸收能力,说明CaFET34在细胞铁离子动态平衡方面发挥着重要作用。对Cafet33△/△和Cafet34△/△缺失菌株在缺铁条件下其它MCO基因表达进行研究,结果表明当白念珠菌中CaFET33/FET34基因缺失或者发生功能障碍时,其它MCO基因会替代缺陷基因而发挥功能。随后我们观察了Cafet33△/△和Cafet34△/△缺失菌株在菌丝诱导条件下的菌落形态。结果发现：在固体菌丝诱导培养基中,CaFET33和CaFET34,尤其是CaFET34的缺失会显著影响白念珠菌菌落周边菌丝的生长,而外源铁的添加并不能回补此缺陷,表明CaFET33和CaFET34以非铁依赖的方式参与白念珠菌菌丝发育。小鼠系统感染实验证实了CaFET34是一种重要的毒力因子,在白念珠菌的致病过程中起着一定作用。构建CaFET34启动子与报告基因LacZ融合质粒,转化野生型、aft2△/△和rin101△/△菌株,在不同pH、不同铁离子浓度条件下测定p-半乳糖苷酶活性,表明Aft2p可能作为转录抑制子调控CaFET34基因的表达。而Rim101p可能作为转录激活子调控CaFET34基因的表达。此外还构建了fth1△/△单基因和fth1△/△fet33△/△双基因缺失菌株,测定了其在缺铁条件下的生长情况、胞内铁含量、代谢转换能力、菌丝以及菌落形态的变化,结果表明fth1△/△fet33△/△缺失菌株胞内铁含量明显降低、代谢转换受阻、菌落表面褶皱形成能力和菌丝聚集明显增强,表明CaFTH1和CaFET33基因产物可能在液泡膜上形成铁转运复合物,参与胞内铁稳态和液泡功能的维持。