基于CaN/NFAT信号途径探讨血府逐瘀汤治疗血管损伤后内皮增生的作用机制研究

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目的:基于CaN/NFAT信号通路,探讨血府逐瘀汤对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响,探讨血府逐瘀汤对大鼠颈动脉损伤模型病理变化的影响、该信号通路标志因子和炎症因子的相关影响,明确血府逐瘀汤治疗血管内膜损伤可能的作用机制,丰富血府逐瘀汤的治疗范围和药理机制。方法:1.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响用BEGM培养基培养人脐静脉内皮细胞。实验用药为血府逐瘀汤冻干粉用无血清培养基BEGM配制成100mg/ml含药培养基,在涡旋仪上充分混匀后,用0.22μm滤膜除菌过滤后,高压灭菌分装保存,4℃冷藏备用。MTS实验检测不同浓度血府逐瘀汤对HUVECs细胞增殖的影响,分为正常对照组(加等体积不含药培养基)、含药培养基组(浓度为6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、37.5μg/ml、50μg/ml),培养24h和48h,分别检测OD值。细胞划痕实验检测血府逐瘀汤对HUVECs细胞迁移和修复的影响,分为对照组(无血清培养基),血府逐瘀汤12.5μg/ml组、血府逐瘀汤25μg/ml组、血府逐瘀汤50μg/ml组。将6孔板封好,放入37℃,5%CO2培养箱,分别于0h、24h、48h镜下拍照(×10)。Real-time PCR检测HUVECs细胞物理损伤后24h和48hCaN/NFAT标志因子的表达量。2.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路调控大鼠颈总动脉球囊损伤术后血管内膜增生的体内实验研究实验一:健康SD大鼠72只,分为6组,假手术组、模型组、他克莫司组、血府逐瘀汤高剂量组、血府逐瘀汤中剂量组、血府逐瘀汤低剂量组。假手术组只结扎颈外动脉,不做球囊扩张损伤,其余各组大鼠行球囊损伤术对大鼠颈动脉造成损伤,给药28天后取材。大鼠颈动脉做HE染色看各组病理形态变化情况,采各组大鼠血清用ELISA法检测血清MCP-1。实验二:取大鼠颈动脉组织,用免疫组化方法检测CaN含量,用Real-time PCR检测各组大鼠颈动脉中CaN、NFATc2、NFATc3、IL-2、TNF-α、COX2、S100A4 mRNA和蛋白表达水平。结果:1.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响MTS细胞增殖实验结果示:24h、48h时血府逐瘀汤6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml浓度有促进细胞增殖的作用,到48h时血府逐瘀汤50μg/ml组表现出抑制细胞增殖的作用。细胞划痕实验结果示:24h、48h时血府逐瘀汤12.5μg/ml、25μg/ml浓度有促进细胞迁移和修复的作用,48h血府逐瘀汤50μg/ml组体现抑制细胞迁移的作用。Real-time PCR结果显示:血府逐瘀汤给药24h,12.5μg/ml、25μg/ml血府逐瘀汤组可显著上调CaN、NFATc1、NFATc2、NFATc3 mRNA的表达量(*P<0.05,#P<0.01);到给药48h时CaN/NFAT信号通路标志因子有表达量下调的趋势,但无统计学差异。2.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路调控大鼠颈总动脉球囊损伤术后血管内膜增生的体内实验研究实验一:颈动脉HE染色结果示:与模型组相比,血府逐瘀汤高剂量组有极少量血管新生内膜,极薄,有少量炎性细胞浸润,平滑肌细胞排列紊乱,弹力纤维板不平整比模型组要有明显改善减轻。血清MCP-1结果示:与假手术组相比各组大鼠血清MCP-1含量具有极显著差异(**P<0.01)。他克莫司组与中剂量中药组血清含量比较未见明显差异(P>0.05),高剂量中药组与他克莫司组比较含量降低,有极显著差异(&&P<0.01)。实验二:免疫组化检测大鼠颈总动脉组织切片CaN的表达结果示:假手术组很少见棕黄色颗粒,模型组有内膜明显增厚,CaN表达呈阳性,可见数个棕黄色颗粒;他克莫司组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组棕黄色颗粒与模型组比较明显减少,提示药物干预后大鼠颈总动脉组织中CaN表达下降。血府逐瘀汤对大鼠颈总动脉组织中CaN/NFAT信号通路标志因子的影响:与假手术组相比,模型组CaN/NFAT信号通路标志因子CaN、NFATc2、NFATc3的基因和蛋白表达水平显著上调(**P<0.01),与模型组相比,血府逐瘀汤高剂量组能显著下调标志因子的基因和蛋白表达水平(##P<0.01)。血府逐瘀汤对球囊损伤后的大鼠颈总动脉中炎症因子的影响:与假手术组相比,模型组炎症因子IL-2、TNF-α、COX2的基因和蛋白表达水平显著上调(**P<0.01),与模型组相比,血府逐瘀汤高剂量组能显著下调三者的基因和蛋白表达水平(##P<0.01)。结论:1.血府逐瘀汤对HUVECs细胞的增殖和迁移在一定浓度剂量有促进作用,而随着浓度的升高有抑制作用,且这种抑制作用会随药物作用时间延长而体现出来。2.血府逐瘀汤对HUVECs损伤后CaN/NFAT信号通路标志因子在初期有促进作用,随药物作用时间延长会体现抑制趋势。3.血府逐瘀汤能有效改善球囊损伤后大鼠颈总动脉内膜增生的病变情况,为研究再狭窄提供基础。4.血府逐瘀汤可以降低大鼠颈总动脉组织中IL-2、TNF-α、COX2含量,能降低血清中MCP-1的含量,具拮抗炎症的作用。5.血府逐瘀汤能抑制大鼠颈总动脉组织中CaN、NFATc2、NFATc3的基因和蛋白表达量,提示血府逐瘀汤可通过CaN/NFAT信号通路抑制内膜过度增生,发挥防治再狭窄的作用。
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