目的:通过建立由H2O2造成氧化应激损伤的HEI-OC1细胞氧化应激模型,验证石墨烯对氧化应激后毛细胞的保护作用。并探究石墨烯减轻毛细胞氧化应激损伤的可能机制。方法:我们将石墨烯材料作为实验组,普通玻片作为对照组。首先用500 μ mol/L、750 μ mol/L、1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L浓度的H2O2处理接种于两种材料上的HEI-OC1细胞,分别作用4h和12h后,通过CCK-8法检测两组细胞存活率的差异,与此同时,通过免疫荧光法观察两组细胞的存活情况。接下来我们利用DCFH-DA和Mito-sox两种分别测定细胞内和线粒体内ROS(活性氧)水平的荧光探针,运用流式分析法和免疫荧光法对氧化应激后的两组细胞内ROS水平的变化进行了直接和间接的检测。随后,我们通过TUNNEL法检测发生氧化应激后两组细胞凋亡水平的差异。由于细胞内ROS的产生主要来源于线粒体,因此我们对发生氧化应激后两组细胞进行了透射电镜的检测,观察两组细胞胞质及线粒体形态的变化。最后,我们利用反应线粒体膜电位水平的Mito-tracker荧光探针,通过免疫荧光技术检测两组细胞荧光强度的变化。结果:1.H2O2处理后,实验组与对照组HEI-OC1细胞存活率实验的结果表明:(1)H2O2处理 4h 后,在 500 μmol/L、750 μmol/L、1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L H2O2浓度下,实验组存活率均高于对照组,其中500 μ mol/L、750 μ mol/L、1mmol/L浓度下两组细胞存活率的差异有统计学意义。(2)H2O2处理12h后,实验组在以上五个H2O2浓度下存活率均高于对照组,其中500 μmol/L、750 μmol/L H2O2浓度下两组细胞存活率的差异有统计学意义。根据以上的实验结果,我们选取500μmol/L的H2O2浓度作为最适浓度,4h作为较适处理时间,用于后续实验。2.H2O2处理后,实验组与对照组HEI-OC1细胞内ROS水平检测的实验结果显示,实验组细胞内的总体ROS水平和线粒体内的ROS水平均低于对照组,且二者具有统计学意义。3.H2O2处理后,实验组与对照组HEI-OC1细胞内凋亡水平检测的实验结果提示,实验组的细胞凋亡率明显低于对照组,且二者差异具有统计学意义。4.H2O2处理后,实验组与对照组HEI-OC1细胞胞质及线粒体形态观察的实验结果发现,实验组的毛细胞内线粒体形态正常且脂褐素较少,而对照组的毛细胞内线粒体发生明显肿胀且脂褐素含量较高。5.H2O2处理后,实验组与对照组HEI-OC1细胞线粒体功能测试的实验结果表明,实验组与对照组相比,HEI-OC1细胞内线粒体代谢水平有所降低,但二者没有发现统计学意义。结论:石墨烯能够显著降低氧化应激后耳蜗毛细胞系HEI-OC1细胞胞质及线粒体内的ROS水平及凋亡水平,对氧化应激引起的耳蜗毛细胞损伤具有保护作用。除此之外,石墨烯还能够减轻氧化应激损伤后耳蜗毛细胞系HEI-OC1细胞内线粒体的肿胀变形,减少脂褐素的产生。因此石墨烯可能是通过抑制凋亡和减轻胞质及线粒体内的氧化应激水平来发挥毛细胞保护作用。