随着生育年龄的推后，环境污染和生活压力增大，不孕症的发生率呈现一个上升的趋势。本课题选取THP-1巨噬细胞及其促血管新生的作用作为切入点，通过研究THP-1巨噬细胞如何上调血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达及其调控的机制探讨其相关的促血管生成作用，为体外受精-胚胎移植(IVF-ET)反复着床失败(RIF)的临床治疗提供实验依据。　　第一章 PGE2上调THP-1巨噬细胞VEGF表达的机制研究　　第一节 PGE2上调THP-1巨噬细胞VEGF表达　　目的:　　为了研究在女性生殖系统中发挥关键作用的巨噬细胞是可能通过何种机制调节促血管生成的作用，我们采用了THP-1巨噬细胞进行了体外细胞学实验，通过Western Blot的方法检测THP-1巨噬细胞内促血管生成因子VEGF蛋白表达水平，初步探讨PGE2能否促进THP-1巨噬细胞合成VEGF的表达。　　方法:　　1.细胞培养和诱导　　选取生长良好的人单核细胞株THP-1细胞， PMA诱导细胞贴壁形成典型的巨噬细胞即为THP-1巨噬细胞。　　2.Westernblotting检测PGE2对THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白表达的影响。　　选取状态良好的THP-1巨噬细胞，分组为:空白处理组、1μmol/L PGE2组、10μmol/L PGE2组，处理THP-1巨噬细胞24小时后，提取细胞全蛋白，WesternBlot分析VEGF蛋白的表达。　　3.SPSS20.0软件对数据处理分析，结果用均数±标准差表示，多样本均数比较应用方差分析，方差齐选用LSD方法，方差不齐则用Duimett T3法，　　结果:　　与空白对照组相比，1μmol/L PGE2组THP-1巨噬细胞内的VEGF蛋白表达明显升高(P＜0.05);与与空白对照组相比，10μmol/L PGE2组THP-1巨噬细胞内的VEGF蛋白表达明显升高(P＜0.05);与1μmol/L PGE2组相比，10μmol/LPGE2组THP-1巨噬细胞内的VEGF蛋白表达亦有明显升高(P＜0.05)。　　结论:　　PGE2能有效上调THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白的表达。并且，PGE2对THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白表达的促进作用与呈浓度-梯度效应。　　第二节 PGE2上调THP-1巨噬细胞VEGF表达的通路研究　　目的:　　采用了PGE2的特异性受体拮抗剂(EP2拮抗剂AH6809或EP4拮抗剂AH23848)或cAMP-PKA通路的特异性抑制剂（腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536或PKA抑制剂H89）预处理后再予PGE2刺激THP-1巨噬细胞，通过Western Blot的方法检测THP-1巨噬细胞内VEGF蛋白表达水平，进一步探讨PGE2调控THP-1巨噬细胞合VEGF表达的机制。　　方法:　　1.细胞培养和诱导　　选取生长良好的人单核细胞株THP-1细胞， PMA诱导细胞贴壁形成典型的巨噬细胞即为THP-1巨噬细胞。　　2.Westernblotting检测PGE2上调THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白表达的通路研究。　　选取状态良好的THP-1巨噬细胞，予PGE2的特异性受体拮抗剂（EP2拮抗剂AH6809或EP4拮抗剂AH23848）预处理后再予PGE2刺激THP-1巨噬细胞，提取细胞全蛋白，Western Blot分析VEGF蛋白的表达。　　选取状态良好的THP-1巨噬细胞，予cAMP-PKA通路的特异性抑制剂(腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536或PKA抑制剂H89)预处理后再予PGE2刺激THP-1巨噬细胞，提取细胞全蛋白，Western Blot分析VEGF蛋白的表达。　　3.SPSS20.0软件对数据处理分析，结果用均数±标准差表示，多样本均数比较应用方差分析，方差齐选用LSD方法，方差不齐则用Duimett T3法，P＜0.05认为差异具有统计学意义。　　结果:　　EP2拮抗剂能抑制PGE2对THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白表达的上调作用，而EP4则无影响。腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536和PKA抑制剂H89均能抑制PGE2对THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白表达的上调作用。　　结论:　　PGE2是通过EP2-cAMP-PKA通路调控THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白的表达。　　第二章 PGE2增强THP-1巨噬细胞促进体外血管新生的影响　　第一节 PGE2影响THP-1巨噬细胞促进HUVECs的迁移能力　　目的:　　上述实验初步证明了PGE2通过EP2-cAMP-PKA通路调控THP-1巨噬细胞VEGF蛋白的表达，从而提示了PGE2可能是通过上调了THP-1巨噬细胞株的VEGF表达从而增强其促血管生成作用。因此我们采用了体外细胞学实验—Transwell细胞迁移实验和Matrigel体外成管实验，予不同处理THP-1巨噬细胞后，取细胞培养上清处理HUVECs，观察HUVECs迁移的数目，验证PGE2是否可以影响THP-1巨噬细胞促进HUVECs的迁移能力以及其影响的可能机制。　　方法:　　1.细胞培养和诱导　　选取生长良好的人单核细胞株THP-1细胞， PMA诱导细胞贴壁形成典型的巨噬细胞即为THP-1巨噬细胞。　　2.体外血管生成实验检测PGE2对THP-1巨噬细胞株促进HUVECs迁移能力的影响。　　3.SPSS20.0软件对数据处理分析，结果用均数±标准差表示，多样本均数比较应用方差分析，方差齐选用LSD方法，方差不齐则用Duimett T3法，　　结果:　　与空白对照组相比，1μmol/L PGE2组HUVECs迁移数目增多(P＜0.05);与空白对照组相比，10μmol/L PGE2组HUVECs迁移数目也明显增多(P＜0.05);与1μmol/L PGE2组相比，10μmol/L PGE2组HUVECs迁移数目增多(P＜0.05);AH6809+ PGE2组的HUVECs迁移数目较10μmol/L PGE2组的少(P＜0.05)，AH23848+ PGE2的HUVECs迁移数目与10μmol/L PGE2组相比无统计学差异;SQ22536+ PGE2组和H89++ PGE2组的HUVECs迁移数目与10μmol/L PGE2组相比均减少(P＜0.05)。　　结论:　　PGE2处理THP-1巨噬细胞后，能明显增强HUVECs迁移的能力。其增强的能力与PGE2呈浓度-梯度效应，这与Westernblot的结果相一致。EP2拮抗剂AH6809、腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536和PKA抑制剂H89均能抑制PGE2增强THP-1巨噬细胞能促进HUVECs迁移能力，提示PGE2通过EP2和cAMP-PKA通路调控THP-1巨噬细胞增强HUVECs的迁移能力。　　第二节 PGE2影响THP-1巨噬细胞促进HUVECs的体外成管能力　　目的:　　上述实验初步证明了PGE2通过EP2-cAMP-PKA通路调控THP-1巨噬细胞VEGF蛋白的表达，从而提示了PGE2可能是通过上调了THP-1巨噬细胞株的VEGF表达从而增强其促血管生成作用。因此我们采用了Matrigel体外成管实验，予不同处理THP-1巨噬细胞后，取细胞培养上清处理HUVECs，观察HUVECs的体外成管面积，验证PGE2是否可以影响THP-1巨噬细胞促进HUVECs的体外成管能力以及其影响的可能机制。　　方法:　　1.细胞培养和诱导　　2.体外血管生成实验检测PGE2对THP-1巨噬细胞株促进HUVECs体外成管能力的影响。　　3.SPSS20.0软件对数据处理分析，结果用均数±标准差表示，多样本均数比较应用方差分析，方差齐选用LSD方法，方差不齐则用Duimett T3法，　　结果:　　与空白对照组相比，1μmol/L PGE2组HUVECs成管面积增大(P＜0.05);与空白对照组相比，10μmol/L PGE2组HUVECs成管面积增大(P＜0.05);与1μmol/L PGE2组相比，10μmol/L PGE2组HUVECs成管面积也明显增大(P＜0.05); AH6809+ PGE2组的HUVECs成管面积较10μmol/L PGE2组的小(P＜0.05)，AH23848+PGE2的HUVECs成管面积与10μmol/L PGE2组相比无统计学差异;SQ22536+ PGE2组和H89+ PGE2组的HUVECs迁移数目与10μmol/LPGE2组相比均减小(P＜0.05)。　　结论:　　PGE2处理THP-1巨噬细胞后，能明显增强HUVECs体外成管的能力。其增强的能力与PGE2呈浓度-梯度效应，这与Westernblot的结果相一致。EP2拮抗剂AH6809、腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536和PKA抑制剂H89均能抑制PGE2增强THP-1巨噬细胞能促进HUVECs体外能力，这和Westernblot的结果以及Transwell的结果相一致，因此证明PGE2通过EP2-cAMP-PKA通路调控THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白表达进而调节血管生成功能。