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棉铃虫是危害棉花的重要害虫之一,转Bt基因棉花的广泛种植很好地控制了棉铃虫对棉花的危害,在很大程度上减少了对化学农药的依赖。但是转Bt基因棉的持续大面积种植,使得害虫长期处于转基因作物Bt毒蛋白的高压选择下而产生的对Bt作物抗性问题愈发严重。已知昆虫对Bt毒素的抗性机制是复杂和多样的,但中肠结合位点钙粘蛋白(CAD)、氨肽酶-N(APN)和碱性磷酸酶(ALP)基因的改变是其中最主要的一种机制。为了能够更好的了解棉铃虫对Cry1Ac的抗性机制随着抗性的变化情况,并明确各种可能的抗性机制在抗性发展的不同阶段起到的作用,本人针对该问题作了进一步的研究和探索,结果如下:1、棉铃虫体内常用的内参基因α-微管蛋白(α-tubulin,α-tub)、β-肌动蛋白(β-actin)、肌动蛋白 2(actin2)、延长因子(Elongation factor 1 alpha,ef-1α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、海藻糖-3-磷酸脱氢酶(Trehalose 6-phosphate synthase,Tps)和18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA,18SrRNA)等七个基因在抗、感棉铃虫不同发育时期、不同组织、不同品系和不同抗性水平之间内参基因的稳定性有很大的差异。q-PCR实验时所用内参基因有严格的使用条件,实验结果表明双内参基因和多内参基因同时使用结果要优于单个内参的使用情况。2、对中肠受体蛋白-钙粘蛋白(CAD)在棉铃虫体内的变化情况系统性研究,发现抗性和毒转正品系棉铃虫CAD的表达量,在棉铃虫的整个世代周期中都有分布的蛋白,蛹期表达量最低。抗性棉铃虫的CAD相对表达量要高于毒转正棉铃虫。两个品系中,CAD表达量最高的时期是在其生长发育的第2龄期。此外,成虫的不同部位和组织之间其表达量也有一定的差异。3、APN为整个棉铃虫世代历期都有分布的蛋白,同样蛹期表达量最低。抗性棉铃虫的APN相对表达量要低于毒转正的棉铃虫。两个品系中,APN表达量最高的时期是在其生长发育的第3龄期;而且就APN的同一龄期而言,其抗性品系各个龄期都表现出比毒转正品系的表达量低,抗性品系表达量最高的3龄期除外。其中毒转正品系幼虫各个龄期的表达量差异不显著。抗性和毒转正棉铃虫表达量随着龄期的变化其体内APN的分布基本上呈倒“V”字形变化。4、ALP的情况与CAD和APN两个受体基因不同,其表达量在抗性品系中各个龄期的表达要高于毒转正品系中的表达,而且除第4龄期差异不显著外,其它各个龄期抗性品系与敏感品系表达量差异达到显著水平;其中在毒转正品系中,APN表达量最高的时期是在其生长发育的第5龄期。抗性品系生长发育则相对于毒转正品系的生长发育要早一些,表达量最高的龄期出现整个世代周期的第3龄期。此外就毒转正品系而言,前5个龄期与抗性品系趋势刚好相反。5、CAD、APN和ALP在毒转正棉铃虫幼虫前肠、中肠、后肠、马氏管和表皮并不是均匀分布的,表达量依次为:中肠>前肠>后肠>马氏管>表皮。在成虫的不同性别、不同部位和不同抗性品系之间表达量分布也不相同6、敏感品系棉铃虫在沉默掉ALP基因后,在生测中没有Bt胁迫的情况下,其死亡率、化蛹率和羽化率与对照相比均没有显著性差异。