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酸性红壤是我国华南地区典型的农业土壤类型,其固磷能力强,导致土壤中累积态磷含量高,但作物难以吸收利用,因此,亟待提高作物磷效率,促进土壤累积态磷的利用。与有益微生物共生,以及促进酸性磷酸酶的分泌均能提高作物磷效率,提高土壤中累积态磷的利用潜力。根瘤菌和丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF）是重要的有益共生菌。紫色酸性磷酸酶（Purple acid phosphatase,PAP）是一类对提高磷效率有突出贡献的酸性磷酸酶。在酸性红壤上,接种根瘤菌对土著AMF,以及磷吸收和产量的影响报道还较少;在分子水平上,根瘤和菌根诱导增强表达的PAP可能的功能还鲜有报道。本研究在前人研究的基础上,以两个磷效率不同的大豆品种和玉米为材料,在酸性红壤上进行不同磷处理和根瘤菌接种的单/间作田间试验,研究根瘤菌接种对大豆/玉米AMF侵染,以及磷活化吸收和产量的影响;同时,利用转基因植株对根瘤诱导表达的大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP21的功能进行分析,解析其参与根瘤中磷代谢的可能机理;此外,借助菌根侵染结构和GUS染色的双定位分析系统,以及蛋白异源表达系统,研究菌根诱导表达的大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP33参与菌根共生系统的可能机理,从而解析有益微生物根瘤菌和丛枝菌根真菌参与作物磷高效利用的可能生理分子机制。主要研究结果如下:1.田间试验结果表明,在减施磷肥条件下,与常规施磷160 kg/hm2相比,减少施磷20%即130 kg/hm2,不减少大豆/玉米产量和生物量,同时,磷处理显著影响大豆和玉米根际酸性磷酸酶活性,40 kg/hm2低磷处理增加了大豆/玉米根际酸性磷酸酶活性,表明田间磷肥有减施潜力。大豆/玉米间作体系具有明显间作优势,间作大豆作为贡献者,促进间作玉米的生长。2.测定大豆/玉米间作根系交互区养分显示,在施磷160 kg/hm2处理下,接种根瘤菌后显著增加根系交互区的土壤有效磷含量;在施磷130 kg/hm2处理下,接种根瘤菌后显著增加土壤速效氮含量。3.与低磷不接种根瘤菌相比,增加施磷或接种根瘤菌后,大豆根瘤数、根瘤干重、根瘤氮磷含量和根瘤氮磷增量均显著增加。然而,接种根瘤菌对大豆/玉米植株氮磷含量和根际酸性磷酸酶活性并没有显著影响。大豆和玉米菌根侵染率均在35%60%之间,施磷显著影响大豆菌根侵染率,但对玉米菌根侵染率无影响。4.比较两个磷效率不同的大豆品种发现,在施磷130 kg/hm2和160 kg/hm2的不同间作模式和接种条件下,与磷低效大豆品种BD2相比,磷高效大豆品种BX10的产量、生物量、根表面积和植株氮磷含量均显著高于BD2。对玉米而言,在施磷130 kg/hm2的接种处理下,与BD2间作的玉米植株氮含量和根际酸性磷酸酶活性要显著高于与BX10间作的玉米。5.对根瘤诱导表达的紫色酸性磷酸酶基因GmPAP21启动子转基因株系进行GUS组织化学定位分析,结果表明,氮磷营养缺乏均显著影响GmPAP21的表达定位。未接种根瘤菌条件下,与LNHP和HNHP处理相比,GmPAP21在LNLP和HNLP处理下受磷饥饿诱导,GUS活性主要在根部、叶部、茎、花、荚和种子中较高,特别是在整个根部及根尖组织中GUS表达更为明显,而在LNHP和HNHP处理下,GUS活性在茎、花、荚和种子都较弱。接种根瘤菌处理后,GmPAP21在LNLP处理的植株根部和根瘤均表达明显,其次为花、茎、叶部和种子,但在HNLP和LNHP处理的根瘤中表达很低,而在HNHP处理的根瘤中不表达。6.过量表达GmPAP21转基因大豆植株接种根瘤菌水培试验表明,在高磷条件下,与野生型大豆相比,过量表达GmPAP21转基因植株显著降低了大豆植株干重、氮磷含量、根瘤干重,以及根瘤氮磷含量,而在低磷条件下,转基因植株与野生型植株间各项指标差异均不明显。结合GmPAP21启动子分析结果表明,GmPAP21是一个新的响应大豆磷饥饿胁迫的紫色酸性磷酸酶,其除了参与植物内部磷的再利用,可能还参与大豆根瘤中的磷代谢。7.对菌根诱导表达的紫色酸性磷酸酶基因GmPAP33启动子转基因株系进行GUS组织化学定位分析,菌根侵染结构和GUS染色的双定位分析结果显示,GmPAP33在根系的表达主要定位在含有丛枝膜结构的内皮层细胞中。烟草叶片表皮细胞和拟南芥原生质体细胞的瞬时表达亚细胞定位结果表明,GmPAP33主要定位在细胞质膜。推测GmPAP33可能参与菌根丛枝膜结构中的磷循环再利用。8.GmPAP33生化功能分析表明,GmPAP33最适pH为4,最适温度为50℃,不同阳离子或阴离子对GmPAP33酶活性影响很大,二价阳离子Mg2+和Mn2+明显刺激了GmPAP33酶活性,其它阳离子K+、Na+、Ba2+、Al3+和Zn2+,化合物钼酸盐和EDTA反而抑制了GmPAP33酶活性。底物特异性分析发现,GmPAP33对所测试底物的活性均较低,表明所测试的底物均不是GmPAP33的最适底物。综合分析推测磷脂类物质可能是其最适底物。结合前人的研究表明,GmPAP33是一个菌根诱导表达的新的紫色酸性磷酸酶基因,其可能参与了菌根丛枝膜结构中磷脂类物质的水解和磷的循环再利用。综上所述,减施磷肥都没有降低大豆/玉米产量;大豆玉米间作具有间作优势,能够明显提高玉米磷吸收和产量;根瘤菌接种效果明显,接种后根瘤性状显著改善,但对大豆和玉米磷吸收和产量促进效果不明显,表明酸性土壤上接种根瘤菌促进磷吸收的潜力还有待于多方面进行挖掘。根瘤诱导表达的GmPAP21除了参与植物内部磷的再循环利用,还参与了根瘤中的磷代谢。菌根诱导表达的GmPAP33可能参与了菌根丛枝膜结构中的磷脂类物质的水解和磷的循环再利用。本研究结果为通过有益微生物途径提高土壤累积态磷的利用,以及提高大豆磷效率提供了理论依据。