目的:近年来,乳腺癌的总体发病率已经位居中国女性肿瘤中第一位,每年大约有7万人死于乳腺癌,死亡人数位于中国女性肿瘤中第六位和妇科肿瘤中第一位。尽管随着分子靶向药物和新型内分泌药物的使用,乳腺癌患者的生存率得到明显提高,但是由于乳腺癌的异质性,不同类型的乳腺癌预后差异较大。临床上雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2均为阴性的三阴性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC),由于缺乏合适的分子靶向药物,而且不适合内分泌治疗,预后很差。化疗是除手术以外,治疗TNBC的主要手段,而化疗耐药的发生是导致TNBC患者治疗失败和死亡的主要原因,目前导致化疗耐药的详细机制并不清楚,因此解析调控TNBC化疗耐药的分子机制非常重要。在本次研究中我们拟通过构建TNBC耐药细胞模型,通过对耐药细胞的表型分析,并结合一系列分子生物学和细胞生物学研究技术,分析探讨导致TNBC化疗耐药的作用机制。方法:1)以TNBC细胞MDA-MB-468为模型,采用小剂量化疗药物体外长期诱导的方法,建立TNBC耐药细胞系;2)对耐药细胞IC50值和耐药指数进行分析,采用Real time PCR、Western blot和免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜的方法,分析耐药细胞中耐药相关基因的表达情况,同时与其他类型的乳腺癌耐药细胞进行对比;3)在不含化疗药物的环境中连续长时间培养耐药细胞,然后分析两株细胞的耐药表型变化情况;4)采用CCK-8实验和克隆形成实验分析耐药细胞的增殖能力;采用伤口愈合实验和Transwell实验分析耐药细胞的迁移和侵袭能力变化情况;5)采用Western blot的实验方法分析亲本细胞和两株耐药细胞中EGFR关键下游信号分子的激活情况;采用Western blot和定量PCR的方法分析亲本和耐药细胞中EGFR、FGFR1、FGFR2等表达的变化情况;6)采用小分子抑制剂抑制FGFR2的活性,观察细胞中P-gp表达的变化;7)采用小分子抑制剂或小RNA干扰技术,结合Western blot的方法分析Erk1/2和STAT3信号通路对耐药细胞中P-gp表达的影响;8)采用小分子抑制剂结合Western blot分析PI3K/Akt/mTOR信号通路对TNBC耐药细胞中P-gp表达的影响。结果:1)成功的建立了两株TNBC耐药细胞系,表型鉴定结果证实这两株细胞均能够对多种化疗药物产生耐药性,即具有多药耐药性;2)这两株耐药细胞同时表达P-gp和BCRP两种耐药蛋白,而且此两株细胞中P-gp和BCRP主要定位于细胞核周围,细胞膜分布很少;3)与亲本细胞相比,这两株耐药细胞均表现出增殖能力显著下降,而迁移和侵袭能力明显增强的现象;4)耐药细胞中Erk1/2的表达与亲本细胞相比明显下降,但是磷酸化Erk1/2的表达水平出现增强;此外,耐药细胞中磷酸化Akt的水平显著增高;5)Western blot和定量PCR的结果证实:与亲本细胞相比,两株耐药细胞均出现EGFR表达明显降低,而FGFR2的表达增高的现象;6)抑制FGFR2的活性能够降低耐药细胞中P-gp的表达,而下调EGFR的表达对耐药细胞中P-gp的表达无显著影响;7)抑制Erk1/2的活性或者下调STAT3的表达对细胞中P-gp表达无影响;8)抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路能够抑制耐药细胞中P-gp的表达水平。结论:成功的建立了两株具有稳定多药耐药表型的TNBC耐药细胞系;TNBC耐药细胞表达P-gp和BCRP两种耐药蛋白,而且此两种蛋白主要定位于细胞核周围,细胞膜定位很少;TNBC耐药细胞表现出增殖能力下降而侵袭能力增强的现象;与亲本细胞相比,耐药细胞发生EGFR向FGFR2转变,而且同时伴随着细胞中Erk1/2和PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活,进一步的研究发现抑制Erk1/2的活性对细胞中P-gp的表达没有显著影响,但是抑制PI3K和mTOR的活性导致细胞中P-gp表达下调,说明耐药细胞中EGFR向FGFR2转换导致PI3K/AKT/mTOR信号通路激活是促进TNBC细胞耐药的重要原因。