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密度感应(quorum sensing)是细菌间通过分泌信号来控制特定基因表达的一种机制。在一些病原菌中,一些毒力基因的表达是受密度感应系统调控的。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是一种革兰氏阴性、发光的海洋细菌,是海洋环境的正常菌群。近些年,哈维氏弧菌成为海水养殖动物(鱼、虾)的重要致病菌,给海水养殖业造成了巨大的经济损失。传统上使用抗生素来对抗哈维氏弧菌引起的感染,这给海洋环境及人类健康造成了极大的危害,因此急需找到一种新的抗感染策略。哈维氏弧菌的某些致病因子是受密度感应系统控制的,因此破坏哈维氏弧菌的密度感应系统是一种新的抗感染的思路。本研究从多个哈维氏弧菌菌株中筛选到三株发光菌株VIB391、VIB295和E022,对其在固体和液体培养基上的发光情况进行了研究。结果表明,在不同状态的培养基上生长时不影响发光菌株的相对发光强度,以VIB391最强,E022次之,VIB295最弱;在平板上生长时发光时间持续最长,而在液体培养基中生长时发光强度均匀,变化明显,有利于实验观察。通过对哈维氏弧菌密度感应系统不同部位突变株的胞外酶(如蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等)的活性进行研究发现,明胶酶的活性受密度感应系统的信号分子HAI-1和AI-2的正控制,且受AI-2的控制程度更大;脂酶也在一定程度上受HAI-1和AI-2的正控制;卵磷脂酶受HAI-1的负控制;溶血素受HAI-1和AI-2共同的负控制。从GenBank中获取哈维氏弧菌中编码AI-2合成酶的luxS基因序列设计一对特异性引物从哈维氏弧菌VIB645中PCR扩增luxS基因,将luxS基因克隆于pUC载体并测序,发现其与GenBank中已发表的哈维氏弧菌的luxS基因序列相似性为90%,证明LuxS/AI-2系统在哈维氏弧菌不同的菌株中的具有一定的特异性,推测LuxS/AI-2系统可能与哈维氏弧菌的致病性或发光现象有关。对哈维氏弧菌VIB645luxS基因序列的进一步分析表明,该基因总长519bp,编码172个氨基酸,分子量19.08kDa,理论等电点为5.07,分子式C834H1335N229O260S11,且这种蛋白不稳定,半衰期约20h左右。为进一步研究LuxS的结构和特征奠定基础。进一步的核苷酸进化分析表明,哈维氏弧菌VIB645 luxS基因的序列与GenBank公布的其它luxS基因序列都有较大的差别。16SrRNA序列系统进化树分析发现,哈维氏弧菌和生黄瘤胃球菌(Ruminococus flavefaciens)及反刍瘤胃亚菌(Prevotella ruminicola)在种属上都有较大的差异,而哈维氏弧菌个别菌株的luxS序列与生黄瘤胃球菌和反刍瘤胃亚菌的luxS序列却有很高的同源性,推测LuxS/AI-2系统可能是通过基因水平传播而获得的,与系统进化的关系不大。许多水产养殖动物病原菌毒力因子的表达与密度感应系统有关,某些芽孢杆菌属细菌产生的AiiA蛋白可降解密度感应病原菌的AHL信号分子,从而可能作为一种新的抗病蛋白用于对病原菌的控制。本研究根据几种芽孢杆菌的aiiA基因序列的保守区设计引物,从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringensis)BF1中扩增出aiiA基因,将aiiA基因克隆于pUC载体并测序,其开放阅读框为753 bp。经Blast同源比对,其序列与已发表的苏云金芽胞杆菌aiiA基因序列的相似性为99%。进一步将aiiA基因克隆于pET-24d(+)表达质粒,AiiA蛋白作为一种带六组氨酸的融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了大量表达。SDS-PAGE分析表明,表达蛋白的分子量约为28 kDa。在37﹑25和17℃时,重组的AiiA蛋白都能得到较好的表达,并且在25℃培养6 h时表达的最好。将表达的重组菌体经超声波破碎后,取其上清液作用于紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ATCC 12472,使其受密度感应系统控制的紫色色素的合成受到抑制;又用上清液分别作用于哈维氏弧菌的发光菌株VIB391和BB886,可使其发光强度分别减弱68%和53%。本研究为进一步探索抗哈维氏弧菌感染的策略奠定了基础。