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盆腔脏器脱垂(Pelvic organ prolapse,POP)是由于盆底支持结构薄弱而造成的盆腔器官下降移位及功能异常的一类妇科疾病,盆底支撑系统的组织结构和功能异常与其病理生理改变密切相关。大量研究表明,来源于间充质干细胞的外泌体对包括结缔组织在内的多种组织具有修复作用。目的通过同种异体骨髓间充质干细胞源性外泌体(Exosomes derived from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSC-Exo)对重度 POP 患者子宫主韧带原代成纤维细胞(human cardinal ligament fibroblasts,hCLF)的作用,探究 BMSC-Exo对该细胞功能活化和表达的促进作用及其潜在作用机制,为临床中对POP的非手术生物疗法提供可能的实验基础和理论依据。材料与方法1 收集意外骨折患者术中截除的髂骨组织并提取骨髓冲洗液,采用细胞贴壁法纯化并传代培养,利用倒置显微镜进行形态学观察,采用流式细胞术测定骨髓间充质干细胞特异性表面标志蛋白进行鉴定。2 选取第3代骨髓间充质干细胞的细胞培养液,通过差速超速离心法分离并纯化其分泌的外泌体,通过透射电子显微镜观察BMSC-Exo的形态、通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)分析其粒径分布及颗粒浓度,并通过Westernblot试验对纯化的BMSC-Exo进行特异性标志蛋白的鉴定。3 收集依据POP-Q评分满足Ⅲ～Ⅳ度绝经后POP患者子宫主韧带组织块,采用贴壁法分离并原代培养hCLF,通过倒置显微镜观察其形态及分布,选取不同浓度梯度的BMSC-Exo对原代hCLF处理不同时间后,采用MTT实验检测作用后hCLF的细胞增殖活性,筛选出BMSC-Exo的最佳作用浓度及作用时间。4 采用以上筛选的作用浓度的BMSC-Exo对原代hCLF处理一定时间后,采用qRT-PCR和Westernblot方法分别从转录水平和蛋白表达水平对hCLF合成胶原蛋白和其代谢酶系以及相关通路的重要分子进行评估。结果1 分离出的BMSC经传代培养后,光镜下见其形态为长梭形或多角形样,呈旋涡状排列。流式细胞学检测显示CD44和CD90均为高表达,阳性率分别是99.74%和97.16%,而CD34和CD45则几乎呈阴性表达。2 电镜下可见BMSC-Exo呈中央凹陷的杯垫状,有膜结构。NTA分析显示其平均直径为78.12±34.45 nm,粒径分布集中于50～110 nm。Westernblot结果证实BMSC-Exo高表达外泌体特异标志蛋白HSP70、CD63和CD9,而几乎不表达内参钙连蛋白calnexin。3 POP患者原代hCLF分布较为稀疏且多形,主要呈长梭形或纺锤形,不规则编织状排列。经MTT试验发现采用20 μL浓度分别为10、20、30及40 ng/mL的BMSC-Exo作用于原代hCLF 24、48和72h后其增殖活力均有提高,呈现一定的时间依赖性,而统计结果显示30 ng/mL作用48h组间差异最具有显著性。4 采用30 ng/mL BMSC-Exo作用于原代hCLF 48h,qRT-PCR检测结果显示外泌体作用组胶原蛋白(COL1A1、COL3A1)及其代谢酶(MMP-9、TIMP-1)以及影响胶原纤维生成通路相关分子(TGF-β1、IL-6)的mRNA表达量较对照组均有所增高,而Westernblot结果表明实验组除MMP-9蛋白减少外,余5种蛋白均有不同程度的提高,Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白比例亦有所提高。结论同种异体BMSC-Exo可促进POP患者盆底韧带中的原代hCLF合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白,并通过下调MMP-9同时提高TIMP-1的表达量,减弱对胶原的酶解活性,重塑盆底结缔组织ECM,有助于改善韧带的强韧性及顺应性。其分子机制可能为BMSC-Exo通过激活TGF-β/Smad信号通路以及与细胞因子IL-6之间的双向促进作用,调节局部的免疫微环境来实现的。