研究背景:复发性流产(Recurrent spontaneous abortion,RSA),又称反复妊娠丢失(recurrent pregnancy loss,RPL),是指孕20周前与同一配偶连续发生的2次或2次以上的妊娠丢失。此外,还有至少一半的病因不明确,称为不明原因复发性流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)。RSA 的发生率约占全部妊娠的1-2%,对妇女及其家庭造成极大的创伤。RSA病理因素非常复杂,该领域的研究主要集中在母体因素,如遗传因素、内分泌异常、子宫结构异常、代谢因素、血栓前状态、免疫因素等方面。考虑到男性提供50%的DNA给发育中的胚胎,所以父系因素导致妊娠丢失并不奇怪。目前研究认为DNA损伤与妊娠丢失有关,精子的表观遗传状态可能是复发性流产的病因之一。但目前对RSA的男性因素研究并不充分,其原因可能在于精子于体外存活时间短,相关研究很难展开。另外,精子是高度分化的细胞,难以进行细胞培养。此外,复发性流产病因复杂,稳定的复发性流产雄性动物模型难以建立,这些方面都制约了复发性流产男性因素的研究。目前关于RSA男性的研究相对缺失并且留有较大的研究空间,所以针对男性因素的研究显得更加重要和迫切。蛋白质是各种生物学过程的最终执行者,蛋白质组学作为后基因组时代一个新兴的研究手段,它从整体水平上对组织或者细胞的蛋白质表达、功能、相互作用进行研究,现在已成为生命科学研究的主要手段之一。精子蛋白质的检测已经实现高通量化,精子细胞很容易在实验室中分离和纯化,并且易于获得,所以非常适合蛋白质组学分析。通过蛋白质组学技术已发现精子的几千种蛋白质,大多数蛋白质的功能相对清晰,主要参与生物学过程,如细胞能量代谢、信号转导和骨架蛋白质形成等。本课题研究之前尚没有从蛋白质组学角度进行RSA男性配偶精子的研究,所以本课题提出了一个大胆的假设,精子蛋白的表达异常可能导致RSA的发生。在过去十几年中蛋白质组学技术不断发展,从二维凝胶电泳(2-dimensional electrophoresis,2-DE),到二维差异凝胶电泳(2D difference gel electrophoresis,2D-DIGE),到高通量的液相色谱串联质谱(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS),结合生物信息学工具以及强大的基因组和蛋白质组数据库,产生的大量数据可以被分析并得到解释,使得蛋白质的大规模分析和鉴定成为可能。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative absolute quantitation,iTRAQ)技术是近年来蛋白质组学常用的高通量筛选技术,iTRAQ技术使用多种同位素试剂标记蛋白多肽,可检测出不同丰度、不同酸碱度以及不同分子量的蛋白,可同时比较多达8种样品,质谱检测更为灵敏可靠。目前iTRAQ技术在精子发生、弱精子症及辅助生殖技术方面应用较多,但在RSA患者配偶精子研究方面未见报道。研究目的:本课题针对不明原因复发性流产,从男性角度出发,利用iTRAQ差异蛋白质组学策略,探明复发性流产男性配偶精子的蛋白组成及差异表达蛋白,寻找潜在有用的生物标记物,对RSA的诊断和治疗提供新的思路和理论依据。研究方法:本课题首次采用iTRAQ偶联LC-MS/MS技术对RSA男性配偶精子蛋白质组进行研究,鉴定精子蛋白成分,建立RSA男性配偶精子差异表达蛋白谱,继而对差异表达蛋白进行生物信息学分析。之后采用免疫印迹技术,对目标差异蛋白进行鉴定,以验证蛋白质组学结果。1.精液参数分析及精子标本的制备:RSA组男性10例,2年内有正常生育史的对照组男性7例,禁欲2-7天,手淫取精,液化后进行精液参数分析。50%percoll一层梯度离心法分离精子,-80℃保存备用。2.利用iTRAQ技术筛选差异蛋白:提取精子蛋白,定量,RSA组和对照组精子样品分别进行iTRAQ试剂标记,RSA组用等量标签121标记,对照组用等量标签1 16标记。经过强阳离子交换,反相液相色谱分离和质谱分析,完成蛋白质检索以及质谱数据鉴定。设定差异倍数为≥1.5倍,且p值≦0.05为筛选标准,完成差异蛋白的筛选。3.差异蛋白生物信息学分析:对差异蛋白进行基因本体(Geneontology,GO)分析以明确蛋白质生物学功能及定位;使用String网站进行蛋白质-蛋白质相互作用分析,确定差异蛋白之间的互作网络关系;利用KEGG数据库进行Pathway显著性富集分析,确定差异蛋白参与的主要代谢途径。4.Westerm Blot实验:抽提精子细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,10%十二烷基硫酸钠凝胶电泳(Sodium salt-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、转膜、免疫杂交、显影及定影。结果:1.本课题首次鉴定了 RSA男性配偶2350个精子蛋白,鉴定38个差异表达蛋白,其中25个表达上调,13个表达下调,可作为RSA的潜在生物标记物。2.进行生物信息学分析,发现这些差异表达蛋白主要定位于精子膜和细胞核中;主要执行生物调控、代谢、细胞过程、蛋白质结合和不同酶活性功能;通路富集分析发现,差异蛋白主要与脂肪酸合成和葡萄糖代谢通路有关,其中表达上调蛋白主要参与了脂肪酸合成代谢途径,表达下调蛋白主要参与了葡萄糖代谢途径。己糖激酶(Hexokinase-1,HKl)、ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate synthase,ACLY)和脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FASN)在代谢通路中显著富集,并且在蛋白作用网络中构成代谢相互作用网络,可作为生物标记物。3.免疫印迹实验进一步验证了三种代谢相关的生物标记物HK1、ACLY和FASN,蛋白表达与质谱结果一致,验证了本课题蛋白质组学的研究结果。结论:iTRAQ技术是研究精子蛋白的强大工具,与传统的2-DE技术相比具有很大的优势。本研究首次系统地揭示了 RSA男性配偶精子的蛋白质组成,共鉴定了 2350种蛋白质,发现了 38种差异表达蛋白,并使用Westerm Blot技术验证了目标蛋白质。差异蛋白主要与生物调控、代谢、细胞过程、蛋白质结合和不同酶活性以及脂肪酸合成和葡萄糖代谢信号通路有关。精子差异蛋白的变化和脂肪酸合成及葡萄糖代谢途径的异常可能是男性因素导致RSA的原因,本课题的研究结果将为不明原因复发性流产的男性致病因素提供新的思路和理论基础。