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H9N2亚型流感是由正黏病毒科、A型流感病毒(AIV)引起的一类低致病性传染病,病原属单股负链RNA病毒,分为8个节段。病毒颗粒分为3层,里层为核壳体;中间层为基质;外层为囊膜,表面散布有神经氨酸酶(neuraminidase,NA)以及能凝集20多种(哺乳动物及禽类)红细胞的血凝素(haemagglutinin,HA),HA是流感病毒主要的抗原决定簇,可直接诱导病毒中和抗体的产生,但HA中的氨基酸序列经常发生抗原漂移,而且不同RNA节段之间的重组也可导致AIV发生抗原转换,产生新型HA分子,AIV病毒这种特性使其在防控中需要不断更新疫苗。在防控禽流感所用疫苗中,灭活或减毒疫苗本身主要诱导体液免疫反应,其存在散毒与毒力返祖或残留的风险,且容易产生疫苗之间的相互干扰现象。较传统疫苗相比,DNA疫苗作为一种新型疫苗具有应答持久、安全稳定、制备贮存方便等优势,能引起细胞免疫中更强烈的CTL应答,并且能够通过构建多基因融合表达质粒以同时达到抵抗多种病原侵袭的作用。本实验以提高H9N2亚型HA-DNA疫苗作用于SPF鸡的免疫应答效果为目的,以具有免疫调节活性的C3d补体成分为研究对象,利用其特异性受体结合区P29作为分子佐剂,依次将HA基因以及不同拷贝数的C3d-P29克隆至pVAX1表达载体,分别构建pVAX1-HA、pVAX1-HA-P29.n(1、2、4)融合表达质粒。通过脂质体转染的方法将以上质粒转染293T细胞进行体外表达实验,IFA检测转染细胞结果证明了其具有特异性荧光。将构建的pVAX1-HA、pVAX1-HA-P29.n(1、2、4)以及对照组pVAX1质粒通过多点肌肉注射的方式以50μg/羽剂量来免疫3周龄SPF鸡,14 d后以相同的用量进行加强免疫。首次免疫后隔周采集血清,应用间接ELISA方法检测血清中细胞因子IFA-γ、IL-4表达水平及抗HA(H9N2)抗体效价。结果显示,免疫后融合表达HA-P29.n(1、2、4)各组的IL-4、IFA-γ与抗HA抗体水平高于pVAX1-HA组且融合P29多串联数与其含量水平有一定的相关性。研究发现C3d-P29会促进IFN-γ的早期生成,各组IL-4水平最大差异出现于二免14 d后,其中以pVAX1-HA-P29.4组IL-4含量最高,表明融合串联的P29对IL-4分泌起到促进作用。MTT法检测鸡脾淋巴细胞增殖活性,不同组对比结果中,pVAX1-HA-P29.n(2、4)组诱导的特异性淋巴细胞增殖活性高于pVAX1-HA-P29.1与pVAX1-HA组。攻毒后通过qPCR检测排毒量、病理组织切片观察及血清HI抗体检测同样表明,pVAX1-HA-P29.n(2、4)组免疫后保护效果更佳。本研究初步研究了禽类补体C3d片段多串联受体结合区P29与H9N2亚型AIV-HA基因融合导入pVAX1核酸质粒后对SPF鸡免疫效果的影响。结果表明C3d-P29补体片段作为分子佐剂可以增强AIV-HA基因诱导的特异性体液和细胞免疫应答,为进一步深入研究C3d-P29以分子佐剂方式作用于AIV核酸疫苗的最佳条件奠定了基础。