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胸腺素α原(Prothymosinα,ProTα)于1984年首次从大鼠胸腺中分离出来,当时被认为是一种胸腺激素,后来发现这种蛋白普遍存在于所有哺乳动物组织中,人ProTα分子量约为12.4kD,由109个氨基酸构成,其蛋白序列富含大量酸性氨基酸,是一种高度酸性的亲水性多肽,等电点为3.5,蛋白结构是一种罕见的非折叠的“天然无结构蛋白”,带负电,免疫原性极差,具有核内定位信号,进化上高度保守,分布极其广泛,淋巴组织及非淋巴组织均可找到,基因定位于第2号染色体上,是哺乳动物中唯一被报道过带有磷酸化谷氨酸的蛋白。基因文库检测中显示人ProTα基因是细胞中表达最丰富的基因之一。 ProTα大量存在于哺乳动物组织中,揭示了这种蛋白具有一定的生物学功能,大量文献显示这种蛋白除具有免疫活性外,在细胞增殖及肿瘤的预测、诊断、治疗中也有很重要的作用,因而ProTα在肿瘤的诊断和治疗机制研究中成为焦点。尽管目前这种基因已被大量克隆,但它们的核苷酸序列不尽相同,曹俊霞提出这种蛋白序列与组织来源不同相关,所以我们克隆、表达了中国健康大学生ProTα基因,经过分析比对发现其序列与先前报道的有所不同,尤其关键的是其N端28个氨基酸(即Tα1的序列)与国内外报道的序列有两个氨基酸差异,故推测该基因与其他ProTα不仅具有相似的生物学活性,可能还具备其他特有的生物学功能。所以本实验对中国人自身克隆表达的重组人ProTα生物学功能进行初步探究,为进一步探索其功能及临床应用提供科学依据。 本实验采用了细胞及动物模型,通过MTT比色法、E玫瑰花环及皮肤移植、伤口愈合等方法对其生物学活性及功能做了初步研究,之后通过2-DE蛋白组学技术观察并分析ProTα在作用THP-1细胞后蛋白表达的变化,在肿瘤标记物方面运用免疫组化、蛋白质印迹法、斑点杂交等方法,初步探讨ProTα在细胞、组织及体液中的表达情况,研究ProTα作为肿瘤标记物的可行性。 结果显示,在生物学功能方面,取得了初步的结果:小鼠在注射0-4μg ProTα时呈递增趋势,在4μg剂量的活性花环成环率平均值比对照组提高15.97%,ProTα还可以提高秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)在辐射后的生存能力,促进小鼠、大鼠伤口在感染及术后的愈合能力,在皮肤移植实验中,可降低自身的排斥能力等;同时我们采用杂交瘤技术制备了小鼠抗ProTα单克隆抗体,并检测了其效价和特异性。利用这种抗体对比分析细胞(Bgc823、HeLa、大脑皮层神经细胞)和正常肝组织中ProTα的表达情况,发现在正常细胞中ProTα主要分布在胞浆,在癌变的组织中,ProTα主要集中在细胞核中,因此我们推测,当细胞质中的ProTα大量表达时对于肝细胞稳定、抑制细胞发生癌变有重要功能,相关机理有待进一步研究,此结果也为研究ProTα在肿瘤发生和诊断奠定基础。台湾成功大学医学院近年来发现膀胱癌患者的尿液中ProTα水平比正常人的尿液中的ProTα水平明显增高,认为ProTα可以作为一种肿瘤标记物,我们对三甲医院提供的乳腺癌、消化道癌确诊病例及正常人尿液中ProTα表达情况也进行了检测比较,结果发现乳腺癌病人的检出率为76%,消化道癌中的检出率高达90%,而正常人只有13%,且表达量也远远低于肿瘤病人尿液,所以证明,ProTα可以作为乳腺癌及消化道癌诊断的初筛。本项研究对进一步揭示ProTα的生物学功能和机制、开发有效简便的肿瘤标记物试剂盒具有重要的理论意义和应用价值。