论文部分内容阅读
生长素是一种重要的植物内源激素，由产生部位转移到作用部位，并以极低的浓度影响植物细胞的分化、分裂、伸长、发育及植物整体形态的建立、生理生化活动等。生长素信号如何被植物接收并对植物生长发育的过程发挥调控作用，其中一个十分关键的因子就是生长素受体。因而，生长素受体一直是生长素信号转导研究中的一大热点。但由于过去很长时间内在生长素受体领域的研究一直停滞不前，所以极大地阻碍了生长素信号转导途径及作用机制的研究。近二十年的研究结果表明，TIRl(transport inhibitor response I)编码一个F-box蛋白，该蛋白与其他几种蛋白在植物体内组装成SCFTIRl蛋白复合体，SCFTIRl对生长素信号转导反应是必需的，但是，对于TIR1基因的功能一直没有得到确证。2005年，Dharmasiri和Kepinski等人的研究证明TIR1直接与生长素结合，并确定TIR1是拟南芥中生长素的受体，从而引起了科学界的广泛关注。随后对生长素受体同源基因家族成员的AFBl-AFB3的研究表明，TIR1及其同源家族成员作为生长素受体在生长素介导的植物发育过程中发挥着重要的作用。
番茄作为典型的跃变型果实，其生长、发育和成熟过程的表观特征变化非常明显，加之遗传背景较为清楚，基因组小而且生长周期短，因而成为研究果实发育及成熟过程的重要模式材料。大量研究结果证实，生长素几乎参与番茄生长和发育的各个方面。近年来，对生长素调控果实发育过程的研究报道明显增多，但是至今没有关于番茄生长素受体基因的分离及其参与植物生长和果实发育的报道。所以，开展番茄生长素受体基因功能的研究将对深入阐明生长素在番茄发育过程的调控机理具有重要意义。
为了研究SlTIR1的生物学功能，本研究开展了以下几个方面的研究：
(1)利用番茄EST序列数据库中的信息，通过电子克隆技术和RACE技术克隆了番茄TIR1同源基因，命名为SlTIRl；生物信息学分析结果表明SlTIR1与AtTIRl的蛋白序列具有很高的同源性，其次分别与AtGRHl、AtAFB2、AtAFB3，一致性/相似性分别为77％/89％、66％/80％、59％/75％、60％/75％。对蛋白保守结构域的分析结果显示，SlTIR1与AtTIRl都含有一个F-box结构域和六个亮氨酸富集重复(LRR)结构域。
(2)采用半定量PCR方法，以番茄的根(root)、茎(stem)、叶(leave)、花(flower)、未成熟绿期果实(immature green)、成熟绿期果实(mature green)、破色期果实(breaker)、红熟期(ripe red)果实等不同组织为材料，对SlTIR1基因进行了组织表达分析，结果表明，SlTIR1在各种组织中都有表达，但在花中表达最强，根中表达最弱；为了进一步明确SlTIR1基因在花中的表达特征，以开花前2天、开花期和开花后4天的子房、雄蕊、花瓣、萼片为材料，采用定量PCR方法对其表达模式进行了分析，结果表明，SlTIR1在花蕾期到开花期的各种花的组成部分中都有表达。从花蕾期到开花期，萼片中SlTIR1表达量升高，而雄蕊中SlTIR1表达量急剧下降。从开花期到开花后4天(果实开始形成)，子房和萼片中SlTIR1表达量都降低。由此推测，花期SlTIR1表达水平的变化可能与果实形成过程密切相关。
(3)为了明确番茄SlTIR1蛋白的亚细胞定位，构建了CaMV35S: SlTIRl-GFP融合表达载体，经转化烟草原生质体，激光共聚焦显微镜检测结果显示SlTIR1定位于细胞核中。
(4)根据SlTIR1基因cDNA序列及番茄基因组数据库中的序列信息，克隆了SlTIR1基因启动子序列，通过生物信息学方法预测了启动子中可能的调控元件，利用相应的激素处理幼苗，用定量PCR方法检测了SlTIRl基因在各种激素处理前后转录水平的变化。结果表明，Ethephon和ABA处理番茄幼苗2h，SlTIRl基因的表达下调；NAA和GA处理幼苗2h，SlTIR1的表达上升；结果表明，番茄幼苗中SlTIR1基因表达受NAA、GA的正调控，受Ethyphon、ABA的负调控。
(5)为了深入研究SlTIR1基因的功能，构建了SlTIR1基因超表达载体并转化番茄，通过对SlTIR1超表达植株形态学特征分析结果表明，SlTIR1基因超表达导致番茄单性结实和叶片形态的改变；同时，SlTIR1超表达后改变了生长素应答基因的转录水平。生理学和分子生物学数据表明，SlTIR1基因在生长素信号转导和番茄果实形成过程中起着正调控作用。本论文的研究结果为阐明果实单性结实的机制奠定了基础。
(6)构建了反义表达载体并转化番茄，对AS-SlTIRl反义载体转基因植株的研究结果显示，相对于野生植株，AS-SlTIR1反义植株的主根变短；生长素处理后形成的侧根数量减少，说明SlTIR1参与调节番茄侧根形成过程。分子生物学研究表明，AS-SlTIR1反义植株中与侧根形成相关基因SlIAA7和SlIAA14的表达水平发生改变。结果表明，SlTIR1可能通过影响SlIAA7和SlIAA14的表达水平调节植物侧根形成过程。