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结直肠癌已成为我国继肺癌、胃癌、肝癌后的第四大最常见癌症。既往研究发现,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在结直肠癌中常出现过表达,并进一步通过其信号转导引起肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤侵袭和转移能力增强,细胞凋亡抑制,因此,EGFR已成为抗肿瘤药物的一个理想靶点。经FDA批准上市,针对EGFR抗原表位研制的单克隆抗体药物有尼妥珠单抗和西妥昔单抗。这两株单抗在治疗EGFR高表达的结直肠癌及其他肿瘤中,能专一的针对肿瘤细胞,减少对正常组织的损害,显著提高患者的生存状态。但其存在一定的不足,首先,分子量相对较大,降低了单抗药物的治疗效果,导致临床使用效果不理想。其次,价格昂贵,且在治疗过程中需长期使用,给病人及家属带来了较大的经济负担。如果能将单抗药物与其靶点结合的位点模拟出来,制成多肽疫苗,就可以避免单克隆抗体药物的不足,大大提高治疗效果,减轻患者的经济负担。模拟抗原表位的方法有两种,通过将噬菌体展示技术与传统的抗原表位分析方法相比,我认为噬菌体展示技术具有独特的优势。噬菌体展示技术是将外源蛋白基因序列插入至噬菌体外壳蛋白,随着噬菌体的重新组装将外源蛋白融合在噬菌体的表面,其在抗原表位筛选中的优点是既可识别并结合肿瘤抗原,又能感染宿主菌进行扩增。噬菌体随机肽库包含大量不同序列结构的多肽,其可以作为任何靶抗原表位的模拟肽,通过肽库对靶抗原进行筛选时,不需要空间构象,只需靶抗原就可获得具有抗原性和免疫原性的蛋白多肽,且反映了抗原结合位点的空间构像。目前该技术在肿瘤的基础研究以及治疗新技术的开发中得到广泛应用。本实验拟用尼妥珠单抗及西妥昔单抗分别作为抗EGFR的靶标蛋白,应用噬菌体随机十二肽库对其抗原表位进行探讨分析。用两株单克隆抗体药物对同一靶点抗原表位进行筛选分析,目前尚未有文献报道。拟经过三轮噬菌体的“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选实验,获得与单抗特异性结合的单克隆噬菌体,进而对噬菌体提取单链DNA并测序,获得抗EGFR抗体对应抗原表位的氨基酸序列,对两株单抗获得的氨基酸序列进行分析比较。采用竞争ELISA检测方法,将筛选出高频的单克隆噬菌体与EGFR高表达的caco2细胞膜蛋白提取液竞争结合西妥昔单抗及尼妥珠单抗,进一步检测所获得的短肽与西妥昔单抗及尼妥珠单抗的亲和活性,并对两株单抗获得短肽的亲和性进行分析比较,以寻找最具亲和活性的短肽。目的1.利用噬菌体十二肽库进行生物淘洗,筛选表皮生长因子受体抗原模拟表位。2.筛选出的模拟短肽的生物活性检测。方法以尼妥珠单抗及西妥昔单抗作为抗EGFR抗原的靶分子,在噬菌体十二肽库中淘选表皮生长因子受体的抗原模拟表位,经过3轮生物淘洗后,挑选单克隆噬菌斑进行扩增,用ELISA方法检测,选择与西妥昔单抗或尼妥珠单抗亲和性较高的阳性单克隆噬菌体,对其进行扩增及测序。采用竞争ELISA的方法,对筛选出的高频噬菌体单克隆与EGFR高表达的caco2细胞膜蛋白提取液竞争结合西妥昔单抗及尼妥珠单抗。结果1.以抗EGFR的单克隆抗体药物西妥昔单抗作为靶标蛋白,利用噬菌体随机十二肽库对靶蛋白进行三轮生物淘洗,对每轮淘洗出来的噬菌体均进行噬菌体滴度测定,测定结果可以看出,西妥昔单抗淘筛出来的噬菌体总体回收率从第一轮的(6.67×10-6)%增加到了第三轮的(2.80×10-3)%,可见通过三轮“吸附-洗脱-扩增”的生物淘洗,噬菌体回收率得到了富集,富集率达到了420倍。用同样的方法对尼妥珠单抗进行淘洗,对淘洗结果进行滴度测定,测定结果可以看出,尼妥珠单抗淘选出来的噬菌体总体回收率从第一轮的(8.67×10-6)%增加到了第三轮的(1.80×10-3)%,可见尼妥珠单抗通过三轮“吸附-洗脱-扩增”的生物淘洗,噬菌体的回收率也得到富集,富集度为208倍。2.在第三轮测噬菌体滴度的平板中,分别随机挑选30个分隔良好的单克隆蓝斑进行扩增,扩增后行滴度测定,以扩增的单克隆噬菌体作为检测组,以噬菌体原库扩增液作阴性对照组,进行ELISA检测。在阳性结果的评价中,以单克隆噬菌体扩增液(检测组)的OD值为噬菌体原库扩增液(阴性对照)的OD值的2倍以上视为阳性。以此标准对ELISA结果进行分析,确定西妥昔单抗的阳性结果有17个,而尼妥珠单抗的阳性结果有21个,阳性率分别为56.67%和70%。这表明西妥昔单抗及尼妥珠单抗均淘筛出来了特异性结合的噬菌体。随机挑选阳性噬菌体克隆进行依赖性分析,可见随着阳性噬菌体投入量的增加,其OD值也增大,说明其存在剂量依赖性。3.对检测出来的阳性噬菌体克隆提取单链DNA,并进行DNA序列测定,找出插入噬菌体的36个碱基,并将其翻译成氨基酸,此即为噬菌体递呈的12肽序列。对17个阳性的西妥昔单抗噬菌体进行测序,有三段短肽频率出现较高,分别为HSFKWLDSPRLR出现6次,HTSSLWHLFRST出现4次,HLFNHNKNLPKR出现3次。对21个阳性的尼妥珠单抗噬菌体进行测序,出现两段频率较高的短肽,分别为HSFKWLDSPRLR出现8次,HWKSSYVKWHNV出现5次。其中西妥昔单抗和尼妥珠单抗有一共有序列HSFKWLDSPRLR。4.在竞争ELISA实验中,EGFR高表达的caco2细胞膜蛋白提取液可以与噬菌体单克隆HSFKWLDSPRLR,HTSSLWHLFRST,HLFNHNKNLPKR竞争性结合西妥昔单抗,三条短肽均出现不同程度的抑制。EGFR高表达的caco2细胞膜蛋白提取液与噬菌体单克隆HSFKWLDSPRLR,HWKSSYVKWHNV竞争性结合尼妥珠单抗,两条短肽均出现不同程度的抑制,且共有序列HSFKWLDSPRLR的抑制率最高。结论初步利用西妥昔单抗及尼妥珠单抗可从噬菌体随机肽库中筛选到表皮生长因子受体相关抗原表位。EGFR高表达的caco2细胞膜蛋白提取液与筛选出的抗原模拟短肽可以竞争性结合西妥昔单抗及尼妥珠单抗。短肽HSFKWLDSPRLR可作为表皮生长因子受体的抗原模拟表位,为进一步研制肿瘤疫苗奠定了基础。