背景和目的:帕金森病(Parkinson disease,PD)是一种常发生于中老年人的神经退行性疾病,其主要病理变化为黑质致密部多巴胺神经元的变性及其导致的纹状体区多巴胺水平的降低。目前,细胞移植是治疗该病的一种理想的方法。而神经干细胞(neural stem cells,NSCs)因其具有自我更新能力及多向分化潜能已成为治疗神经退行性疾病的理想细胞供体。虽然以NSCs移植治疗PD的实验研究已取得较好的疗效,但由于缺乏可靠的示踪技术,难以对移植细胞进行追踪观察和检测,对临床疗效的确定缺乏有力的证据。为了探讨NSCs移植治疗PD的细胞学机制,本研究分别从孕14天的SD胎鼠中脑和新生的转绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)基因小鼠的海马分离NSCs,体外培养扩增后移植到PD模型大鼠的纹状体内,观察大鼠的行为学变化以及移植细胞在脑内的存活、分化等情况,为临床应用提供理论依据。研究内容与方法:(1)以机械吹打法分离孕14天胎鼠中脑细胞,接种于含bFGF、EGF和B27的DMEM/F12无血清完全培养基中培养。通过巢蛋白(Nestin)的特异性显色对培养的NSCs进行鉴定;以10%DMSO+10%FBS+15%B27+DMEM/F12作为冷冻保护液冻存细胞,解冻后检测细胞活力,并对NSCs进行生物学鉴定;采用含胎牛血清的培养基对NSCs诱导分化后,分别通过检测特异性的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、特异性的烯醇化酶(NSE)来鉴定星形胶质细胞和神经元,确证NSCs分化的潜力。(2)将培养扩增、经5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记后的NSCs定向移植到PD模型大鼠的纹状体内,以阿朴吗啡(apomorphine, APO)诱导观察大鼠旋转行为的变化;并于不同时间对脑纹状体取材、冰冻切片,免疫组化观察移植细胞在脑内的存活与分化情况。(3)从新生GFP小鼠海马分离NSCs,采用无血清培养基培养,免疫细胞化学检测NSCs特征性标志nestin表达和分化为神经元和神经胶质细胞能力。将培养扩增后表达GFP的NSCs移植到PD模型大鼠的纹状体内,检测大鼠的行为学变化;荧光显微镜下检测荧光细胞的分布和迁移,免疫组织化学染色检测移植细胞在纹状体微环境内向多巴胺能神经元分化的状况,分析NSCs移植治疗PD的机理,为NSCs纹状体内移植治疗PD的可行性提供实验依据。结果:(1)机械吹打胎鼠中脑腹侧组织分离NSCs,其平均存活率为90%。细胞培养6天后传代,传代后的NSCs增殖生长迅速,本实验已传到6代;用同样方法从新生GFP小鼠海马分离的NSCs生长良好,连续传5代后,单个细胞和神经球均正常表达GFP;两种细胞经Nestin鉴定呈阳性,证明增殖的细胞为NSCs。(2)分离的两种细胞在分化培养基中诱导后,免疫细胞化学鉴定显示可分化为神经元和神经胶质细胞,证明分离的NSCs具有多向分化潜能。(3) P0-P3代的NSCs在液氮冻存,解冻后细胞的存活率在54%～66%之间,复苏后仍保持原有的NSCs特性。(4)与对照组相比,细胞移植组都可使PD鼠的旋转行为得到明显改善,治疗效果在4-6周达到最佳。(5)移植细胞在宿主体内的存活、分化和迁移情况。①存活:细胞移植后,可在纹状体内见到BrdU标记的细胞和GFP细胞,其至少可存活8w。②分化:在移植后4w,免疫组化检测可见针道周围有TH阳性细胞出现,说明NSCs在纹状体内能定向分化为多巴胺能神经元。③迁移:移植后的两种细胞并不局限于注射位点,部分细胞向周围迁移并有一定的走向,但来源于新生的GFP转基因小鼠的NSCs可以更好的观察移植细胞的迁移情况。(6)从GFP转基因小鼠中分离的荧光细胞移植后,可以动态的观察其在宿主体内的存活、分化和迁移情况。在移植治疗神经系统疾病方面,其可以作为一种较高应用价值的示踪种子细胞。结论:本实验以机械分离法获得的NSCs在无血清培养基培养后,能够不断增殖且保持NSCs的生物学特性。将其定位移植到PD模型大鼠纹状体内,可明显改善后者的行为。移植细胞能在PD模型大鼠纹状体的存活、迁移,并分化为多巴胺神经元以替代损伤的该种神经元而达到治疗PD的目的。本研究结果为帕金森病等神经退行性疾病的临床治疗提供实验依据。