【摘 要】
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【目的】通过生物信息学方法,综合多个数据库分析ANLN在黑色素瘤患者中的变化情况并探究其潜在的上下游靶点。随后通过构建敲低ANLN稳转黑色素瘤细胞系,进一步探究ANLN在黑色素瘤发生发展中的生物学功能及其可能存在的调控机制。【方法】生物信息学分析:1、首先从TCGA、GTEX、GEO、Oncomine等数据库下载正常皮肤和黑色素瘤样本基因芯片数据进行差异分析,验证ANLN的mRNA表达水平。2、使
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【目的】通过生物信息学方法,综合多个数据库分析ANLN在黑色素瘤患者中的变化情况并探究其潜在的上下游靶点。随后通过构建敲低ANLN稳转黑色素瘤细胞系,进一步探究ANLN在黑色素瘤发生发展中的生物学功能及其可能存在的调控机制。【方法】生物信息学分析:1、首先从TCGA、GTEX、GEO、Oncomine等数据库下载正常皮肤和黑色素瘤样本基因芯片数据进行差异分析,验证ANLN的mRNA表达水平。2、使用HPA（人类蛋白图谱数据库）验证ANLN在正常和黑色素瘤样本中蛋白表达水平。3、CancerSea数据库从单细胞水平探究ANLN基因在黑色素瘤中发挥的生物学功能。4、使用FunRich软件和TargetScan等在线工具预测ANLN基因可能的上游microRNA并在GEO数据库中验证预测microRNA在正常和黑色素瘤样本中的表达水平。体外细胞实验:1、使用HaCat（人永生化表皮细胞）,A875（人黑色素瘤细胞）,SK-MEL-28（人黑色素瘤细胞）三个细胞系,qPCR验证其mRNA表达水平,WB验证其蛋白表达水平。2、构建ANLN敲低的稳转黑色素瘤株,qPCR和WB验证其敲低水平,Transwell和平板克隆检测细胞增殖,迁移,侵袭,流式细胞术检测细胞周期和凋亡等生物学功能。3、在HaCat,A875和SK-MEL-28三个细胞株中验证上游靶microRNA表达水平,并在A875和SK-MEL-28中转染miRNA-NC和miRNA-mimic,构建过表达的microRNA细胞,qPCR检测下游靶基因ANLN变化水平。体内动物实验:1、选取6-8周龄裸鼠,皮下注射sh-NC和sh-ANLN的A875细胞系,观察裸鼠成瘤情况。2、监测记录肿瘤的体积与重量,比较正常组和敲低组肿瘤体积和重量差异。3、取下肿瘤组织进行免疫组织化学染色查看P53和Ki67表达水平变化。【结果】ANLN在黑色素瘤样本和黑色素瘤细胞系中呈显著高表达,高表达ANLN黑色素瘤患者显示较差的预后。CancerSea数据库分析显示在黑色素瘤中,ANLN主要和细胞周期,细胞转移,侵袭以及EMT等生物学过程显著相关。随后细胞实验结果显示在敲除ANLN的黑色素瘤细胞系中细胞增殖,迁移和侵袭能力都显著下降。流式细胞周期和凋亡检测结果显示敲除ANLN基因后黑色素瘤细胞凋亡明显增加,并且主要阻滞在G2/M期。FunRich和TargetScan预测分析显示miR-200b可能是ANLN上游靶microRNA,qPCR结果也显示过表达miR-200b后其下游ANLN表达呈显著下降。KEGG功能注释分析显示ANLN及其相关蛋白主要富集在P53信号通路和细胞周期等生物学过程,同时蛋白免疫印迹结果显示P53蛋白在ANLN敲低的黑色素瘤细胞系中表达显著下调,提示P53信号通路可能参与了黑色素瘤恶性生物学过程。裸鼠皮下瘤结果发现敲低ANLN基因后皮下瘤增长速度明显降低,免疫组化结果也显示Ki67在敲低ANLN基因后表达明显下降,P53表达明显增高。【结论】ANLN基因在黑色素瘤中上调与肿瘤的恶行进展过程显著相关,其高表达促进黑色素瘤的增殖,转移和侵袭等恶行进展过程,提示我们ANLN可能是临床诊治黑色素瘤的一个有效生物靶标。同时实验结果进一步揭示ANLN基因可能通过miR-200b/ANLN/CDK1轴调控黑色素瘤细胞周期进程,进而影响P53信号通路从而发挥促黑色素瘤发生发展过程。
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