蛋白质翻译后修饰是调节蛋白质稳定性和功能的最重要的机制之一,目前人们已经采用了各种策略来分析泛素化蛋白质组。但是,无论在研究整体蛋白泛素化,还是单一蛋白泛素化,泛素化偶联物都以较低的水平存在。虽然泛素化修饰属于高丰度的翻译后修饰类型,但是它在整体蛋白质组中的含量比例是较低的,只占了总蛋白质组的1%甚至更低。26S蛋白酶体以及去泛素化酶的作用导致泛素链易被催化去除,如果没有预先对低丰度的泛素化蛋白进行富集,很难识别泛素偶联物。因此,如何高效的富集和纯化泛素化蛋白成为泛素化研究的关键问题。本试验通过全基因合成一种可以与多聚泛素化链结合的诱饵蛋白,该诱饵蛋白是由两个重复的UBD(ubiquilin 2-derived UBA,UQ2,575-624 amino acids;RABGEF1-derived A20-Zn F,A20,9-73 amino acids)结构域重复两次构成,并将该序列连接在GST标签的C末端,使其能够表达融合有GST标签的诱饵蛋白。将构建好的重组质粒转入到大肠杆菌中,IPTG诱导蛋白的表达。从诱导浓度和诱导时间对重组蛋白GST-HzUBD的诱导条件进行优化,比较了两种琼脂糖树脂耦合诱饵蛋白的效率以及对泛素化蛋白的富集效果,同时利用液相色谱串联质谱技术对富集后的样品进行上机检测。主要结果如下:(1)在16℃0.1 mM IPTG诱导12 h为重组蛋白GST-HzUBD的最佳诱导条件。对成功诱导的重组蛋白GST-HzUBD进行纯化,利用GST标签抗体通过Western Blot技术对纯化置换后的诱饵蛋白进行检测,结果表明成功的获得了融合有GST标签的诱饵蛋白。(2)NHS活化型琼脂糖树脂通过与诱饵蛋白形成稳定的共价键,以防止诱饵蛋白的大量洗脱,并能富集到更多的泛素化蛋白。MG132抑制26S蛋白酶体以及去泛素化酶的活性而增加泛素化蛋白的含量。通过细胞实验在试验组加入50μM MG132,对照组加入等量的DMSO,Western Blot结果表明MG132处理后细胞内的泛素化蛋白含量明显增加,相比于对照组,实验组富集到更多的泛素化蛋白。(3)利用液相色谱-串联质谱联用技术检测到1786个蛋白,对其进行通路分析表明泛素化修饰不仅介导蛋白质的降解,还参与了包括细胞凋亡、DNA损伤修复、转录调控、免疫应答和细胞周期等诸多细胞过程的功能的调控。由于本试验是在非变性条件下利用杂合串联结构域进行的富集过程,因此除了可以富集泛素化蛋白外,同时还富集到与泛素化蛋白存在相互作用的蛋白,例如E3连接酶等。本试验为系统性研究泛素化修饰参与各种生物过程的研究提供了方法基础。