手性烷烃化合物是有机合成中常用的重要合成砌块，可以用来制备手性药物及其中间体。烯烃不对称还原是制备这类化合物的重要策略之一。生物催化在这一领域也开始取得快速的发展和进步，其中采用烯醇还原酶可以不对称催化还原带有强吸电子基团的碳碳双键化合物，得到一个或两个手性中心的光学纯缺电子烷烃化合物。烯醇还原酶广泛存在于微生物，尤其是细菌和低等的真菌，以及高等植物甚至寄生虫中，但其酶源的发掘工作还远远不够，目前常用于烯烃不对称还原研究的重组酶不过二十多种。进一步发掘和利用新酶，同时发展异源表达的重组烯醇还原酶在不对称还原中的应用，大力扩展烯烃不对称还原的工具酶库的研究工作具有重要意义。　　本文主要以无色杆菌(Achromobacter sp.) JA81基因组中假定的3个烯醇还原酶Achr-OYE2、Achr-OYE4和Achr-OYE5为研究对象，通过对这3个在标准培养条件下并未转录和翻译的老黄酶家族成员进行异源表达，获得新型具有自主知识产权的重组烯醇还原酶，并通过对其酶学性质进行表征，研究其在贫电子烯烃不对称还原中的催化性能，对不同底物的适应性和结构功能关系，扩展该类酶催化剂的种类和底物谱，并建立重组酶与外部辅酶循环偶联的反应体系，为进一步扩展其底物谱和应用性奠定基础。首先通过优化表达载体和宿主菌株，实现了3个烯醇还原酶的活性表达;并对蛋白纯化策略进行改进，通过一步亲和层析的纯化方法制备出高纯度的活性蛋白。在对3个烯醇还原酶的序列比对和特征光谱性质分析中确定它们为典型的FMN辅酶结合型的黄素蛋白。随后对3个烯醇还原酶的催化性能进行了初步研究，Achr-OYE2对测试底物基本没有催化活性，Achr-OYE4展示出比Achr-OYE5更高的活性。此外，Achr-OYE4和Achr-OYE5对两种辅酶NADH和NADPH均可以利用，但辅酶偏好性有所不同:Achr-OYE4倾向于利用NADH，其对NADH的亲和力以及催化效率(kcat/Km)均高于对NADPH;而Achr-OYE5则对辅酶NADPH更具有偏好性。以3个烯醇还原酶中活性较高且具有典型老黄酶吸收光谱特征的Achr-OYE4为代表，对其催化的反应体系和底物适应性做了较为深入的研究。确定其最适反应pH为7.5，在此pH值时酶活最高，在酸性和碱性pH条件下酶活明显下降。同时发现不同缓冲液种类对酶活具有显著影响，在测定的缓冲液中，Tris-HCl缓冲体系中活性最高，且在此体系中的最适反应温度为30℃;在磷酸盐缓冲体系中，最适反应温度为35℃。Achr-OYE4热稳定性相对一般，在温度不高于30℃时较为稳定，其在30℃时的半失活时间为64.8±4.4h。Achr-OYE4对一些α,β-不饱和环状酰亚胺、α，β-不饱和酮、α,β-不饱和羧酸酯和α，β-不饱和硝基类化合物均展示出了较高的催化活性和立体选择性。其中，对α，β-不饱和环状酰亚胺类底物2-甲基-N-苯基马来酰亚胺的催化活性和立体选择性最好(yield＞99％，ee＞99％)。结合Achr-OYE4的最适反应条件进而构建了NADH和NADPH两种辅酶再生体系，避免了因还原型辅酶因子的昂贵价格而限制了其在不对称还原中的应用，其中NADH辅酶再生反应体系取得了较好的催化效果，对部分底物的转化率和产物光学纯度均大于99％。同时，对底物结构对酶活影响和副产物生成机理进行初步探讨。作为无色杆菌属中首次被详细进行酶学性质表征与在碳碳双键不对称还原制备手性化合物中进行应用的烯醇还原酶，Achr-OYE4将作为对不对称还原工具箱的一个重要补充，并且为今后本菌属中其它烯醇还原酶的研究和应用提供有益借鉴。