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目的：卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤，在现有手术、放疗、化疗治疗手段下，卵巢癌5年生存率一直徘徊在28%～35%，故有必要寻找新的治疗方法，以进一步提高卵巢癌患者的生存时间。卵巢癌和其它恶性肿瘤一样是涉及多基因改变的疾病。因此，基因治疗可能是其根本的治疗途径。许多研究表明，癌基因及抑癌基因的过度表达对卵巢癌的生物学行为及预后有影响。目前大部分实验资料表明原癌基因Ｃ-erbB2在大约20%～40%的卵巢癌中存在基因扩增和其蛋白产物的过度表达。有作者对卵巢癌细胞株进行研究，发现Ｃ-erbB2过度表达者侵袭力强，恶性程度高，说明Ｃ-erbB2表达与卵巢癌的生物学行为有一定关系。Flip等研究Ｃ-erbB2的过度表达与卵巢癌预后及化疗的关系，结果显示：晚期肿瘤、手术有残余瘤及对化疗不敏感者，Ｃ-erbB2表达率高，有统计学意义。且Ｃ-erbB2阳性者预后明显不良。Berchuck等及Masood也发现，Ｃ-erbB2过度表达者预后不良。提示Ｃ-erbB2与卵巢癌的预后呈负相关。由于C-erbB2原癌基因在卵巢癌中主要以扩增和高表达形式存在，在理论上，应用C-erbB2反义核酸有可能封闭其癌基因的高表达，从而抑制肿瘤细胞增殖达到治疗目的。本实验利用C-erbB2反义寡核苷酸作用于人卵巢癌细胞株SKOV3，体外观察其对卵巢癌细胞增殖、凋亡和C-erbB2<WP=4>癌基因表达产物的影响，初步探导C-erbB2反义寡核苷酸抗肿瘤机制，为卵巢癌的的治疗提供新的思路。方法：1.反义寡核苷酸的设计 设计顺序互补于人的C-erbB2 mRNA 5’端起始编码区的15个碱基序列的反义寡核苷酸，并合成相应的正义寡核苷酸作对照，反义和正义寡核苷酸均经硫代磷酸化修饰。2.细胞培养 将处于指数生长期的卵巢癌SKOV3细胞以5×104个/ml浓度加入24孔培养板中，每孔加1ml。培养24小时，细胞贴壁后分反义组、正义组和空白组三组，分别往每组中加入等量5μMol/L的反义、正义寡核苷酸和无菌双蒸水共同培养。3.绘制细胞生长曲线 采用细胞计数法描绘细胞生长曲线。4.形态学观察 倒置相差显微镜和HE染色法从形态学上观察细胞凋亡的情况。5.DNA Ladder测定 提取细胞DNA，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进一步检测发生凋亡的特征性DNA降解。6.流式细胞术分析 采用流式细胞仪定量分析三组卵巢癌细胞凋亡率及细胞周期特异性和P185蛋白表达情况。结果：1.细胞生长曲线 采用细胞计数法描绘出三组细胞生长曲线，由曲线可知经C-erbB2反义寡核苷酸处理的SKOV3细胞生长缓慢，表现出明显的生长抑制，而正义组及空白组细胞则正常生长。2.形态学观察 倒置相差显微镜观察，正义组细胞生长良好，细胞透明，密度较大，呈复层性生长，细胞呈梭形，胞浆内颗粒较少，细胞核隐约可见。反义组细胞密度明显减小，细胞颗粒较多，细胞间界限模糊，漂浮细胞数量增加，存活细胞显著减少。经HE染色后进行光镜观察，可看到细胞形态<WP=5>也出现了明显改变，正义组细胞呈梭形，形态饱满，细胞核染色均匀，核仁清晰可见，而在反义组细胞中出现细胞质浓缩，变圆，核碎裂等，提示反义组细胞出现凋亡的形态学改变。3.DNA Ladder测定 提取反义组和正义组细胞DNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示反义组细胞DNA出现凋亡的特征性改变，即DNA呈梯度样降解。正义组细胞DNA未出现凋亡的特征性改变。进一步证明反义寡核苷酸诱导卵巢癌细胞凋亡。4.细胞凋亡率变化 流式细胞仪检测表明反义组细胞24小时的凋亡率9.02%，而正组及空白组细胞凋亡率分别为2.67%和2.98%。随时间延长，凋亡率增加，72小时反义组细胞凋亡率达到15.92%,正义组和空白组细胞凋亡率则为3.94%和4.02%。反义组凋亡率与正义组及空白组相比较，差异有显著性（P<0.01）。而正义组及空白组比较，差异不明显（P>0.05）。提示C-erbB2反义寡核苷酸诱导卵巢癌细胞凋亡。5.细胞周期与增殖指数变化 细胞周期分析表明反义组细胞于G0～G1期细胞分布率为73.77%，而正义组及空白组为67.28%和66.72%反义组和正义组及空白组相比较，p<0.05,说明分布率差异有显著性。S期和G2～M期细胞分布百分率则相反，即反义组细胞在此两期内细胞分布百分率减少，正义组及空白组细胞分布百分率增多，S期反义组为13.83%,正义组和空白组为15.33%,16.31%。G2～M期反义组为12.68%,正义组和空白组分别为17.56%和17.08%，增殖指数反义组细胞为26.48%，正义组及空白组细胞分别为32.86%和33.34%，反义组与正义组及空白组细胞增殖指数比较，<WP=6>（P<0.05），差异有显著性。表明C-erbB2反义寡核苷酸作用卵巢癌细胞后使细胞停滞在DNA合成前期，抑制细胞增殖，并在此期诱导细胞凋亡。7.P185蛋白表达量 流式细胞仪间接免疫荧光法检测C-erbB2癌基因蛋白表达即P185蛋白相对含量24小时反义组为6.27，正义组及空白组分别为8.42和8.37，随作用时间延长,P185蛋白相对含量逐渐降低， 72小时后反义组细胞P185蛋白相对含量为5.12，正义组及空白组细胞P185相对含量为7.47和7.53，反义组细胞P185蛋白表达量与正义组和空白组细胞P185蛋白表达量比较，p<0.01,差异有显著性。提示C-erbB2反义寡核苷酸能特异性降低卵巢癌细胞P185蛋白表达量。结论：本实验所设计的C-erbB2硫代反义寡核?