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目的2020年数据显示,肺癌占我国恶性肿瘤死亡的首位,肺腺癌的比例高达40%。肺腺癌细胞的辐射敏感性较差,具有放疗顽固性,因此对于放射治疗非小细胞肺癌中电离辐射作用机制的研究十分重要,涉及电离辐射引起细胞发生自噬、早衰等细胞反应。探究辐射损伤相关机制,即电离辐射诱导肿瘤细胞发生早衰,对提高其辐射敏感性有着重要意义。降低肿瘤细胞的辐射抗性,提高敏感性,可以通过电离辐射诱导细胞发生自噬和早衰,达到促进细胞死亡的最终目的。目前在肺腺癌A549细胞中电离辐射引起的早衰与自噬及相关调控关系尚不明确。前期研究发现,X射线能引起A549细胞发生早衰,且早衰的发生部分依赖于信号传导与转录激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3）。STAT3 是 Beclin1 的上游基因,能够结合到 Beclin1 启动子区域促进Beclin1的表达,而Beclin1在细胞自噬中发生重要作用,也能够影响细胞早衰的发生。因此推测电离辐射诱导A549细胞发生的早衰与自噬间存在一定联系,在此基础上,进一步探究X射线引起的自噬与细胞发生衰老分泌相关表型（Senescence Associated Secretory Phenotype,SASP）的关系及相关的信号通路。目前X射线引起A549细胞发生早衰与自噬间的关系尚未阐明,因此探究电离辐射诱导A549细胞发生的早衰与自噬间的调控关系及相关机制对于肿瘤的放射治疗与临床研究具有较高的参考价值和实际意义。方法1.4 Gy X射线照射A549细胞后,分别培养24、48和72 h后,利用β-半乳糖苷酶（Senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal）染色实验检测细胞早衰发生情况,Western Blot检测衰老相关蛋白p62及自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白轻链3-1（Light Chain 3-1,LC3-Ⅰ）和微管相关蛋白轻链3-Ⅱ（Light Chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ）的表达。2.利用衰老通路调控蛋白 ATM（Ataxia Telangiectasia-mutated gene,ATM）和 ATR（ATM-Rad3-Related gene,ATR）抑制剂 KU-55933 和 VE-821 抑制 A549细胞早衰的发生后,4 Gy X射线照射,培养72h后,Western Blot检测细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达。3.利用Beclin1 RNAi腺病毒载体GV119感染A549细胞,4 Gy X射线照射后72 h,β-半乳糖苷酶染色实验检测A549细胞的早衰发生情况,统计早衰细胞阳性率;Western Blot 检测 Beclin1、p62 和 GATA结合蛋白 4（GATA-binding protein4,GATA4）表达,qRT-PCR检测细胞SASP早衰的发生。4.利用Beclin1+/-小鼠进行体内验证。4 Gy X射线照射Beclin1+/-小鼠后24 h处死小鼠,利用苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,HE）实验检测小鼠组织器官病理变化,免疫组织化学法（Immunohistochemistry,IHC）检测Beclin1、p62和GATA4蛋白在各组织器官中的表达,qRT-PCR检测细胞SASP早衰的发生。5.统计方法:采用SPSS 26.0统计软件对实验数据进行分析,实验与对照组间比较采用独立样本t检验及单因素方差分析,以α=0.05为检验水准,以P<0.05、P<0.01、P<0.001和P<0.0001为差异具有统计学意义,采用GraphPad Prism 8进行作图。结果1.4 Gy X射线照射A549细胞24、48和72 h后,β-半乳糖苷酶染色结果显示细胞发生早衰的水平随照后时间增加,照射后细胞形态发生改变,细胞体积增大,由较为细长的多角梭形变为棱角不明显的多边形和圆形,染色呈蓝色的细胞数增多,即早衰细胞阳性率显著增加,Western Blot检测到p62蛋白表达显著上升,差异具有统计学意义。同时通过Western Blot检测A549细胞自噬发生的变化,结果显示Beclin1的表达较48h明显下降,且与0 Gy组相比明显下降,差异具有统计学意义,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值在72h降低,差异具有统计学意义。2.在ATM、ATR早衰抑制剂KU-55933和VE-821的作用下,与未处理组相比,实验组A549细胞中的Beclin1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值无显著差异。同时4 Gy X射线与KU-55933和VE-821联合处理组与4 Gy X射线照射组相比,Beclin1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值均无显著差异。3.与GV119-NC组相比,GV119-Beclin1组A549细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率显著下降;4GyX射线照射后72h,SASP早衰相关蛋白IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达显著增加。β-半乳糖苷酶染色阳性率低于未敲低Beclin1的照射组细胞,差异有统计学意义。Western Blot结果显示,4 Gy X射线和Beclin1敲低联合处理组与4 GyX射线照射组相比,照射后72h,p62和GATA4蛋白表达显著降低,SASP早衰相关蛋白IL-6和IL-8的mRNA表达降低,差异具有统计学意义,VEGFA表达升高,差异具有统计学意义。4.HE染色结果显示Beclin1+/-小鼠小肠及脾脏与野生型Beclin+/+小鼠相比,无明显差异。野生型Beclin1+/+小鼠在4 Gy X射线照射后小肠发生病理改变,脾组织内白髓体积存在轻度至中度缩小;4 Gy X射线照射Beclin1+/-小鼠后小肠结构未见异常,脾组织内白髓体积存在轻度至中度缩小。与0 Gy组相比,4 Gy组小鼠组织IL-6和IL-8表达增加,差异具有统计学意义;4 Gy X射线照射Beclin1+/-小鼠后,组织中IL-6和IL-8表达降低,差异具有统计学意义;各器官中,肺组织中Beclin1表达降低,心脏、肺和脾组织中p62蛋白表达增加,肺和脾组织中GATA4表达降低,差异具有统计学意义。结论1.4 Gy X射线能够诱导非小细胞肺癌A549细胞发生早衰,同时影响自噬的发生。2.4 Gy X射线通过Beclin1介导的自噬调控细胞早衰的发生,即4 Gy X射线引起的早衰部分依赖于自噬。3.4 Gy X射线通过Beclin1-p62-GATA4-SASP通路诱导A549细胞发生自噬并导致早衰的发生。4.4 Gy X射线照射导致细胞因子IL-6和IL-8的mRNA表达发生改变,诱导A549细胞和小鼠体内发生SASP早衰。5.4 Gy X射线影响野生型Beclin1+/+及Beclin1+/-小鼠体内自噬蛋白Beclin1与SASP早衰通路p62和GATA4蛋白的变化,说明在小鼠体内电离辐射也能够通过Beclin1-p62-GATA4-SASP通路调控早衰的发生。