论文部分内容阅读
背景及目的细菌耐药是威胁人类安全的严重公共卫生问题之一。耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE）因具有检出范围广、传播迅速、多重耐药性和血流感染高病死率的特点,被美国疾病预防与控制中心列为三大最具威胁性的耐药菌之一。据我国三级医院细菌耐药监测数据显示,2005年肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的总耐药率不足1%,但至2019年逐渐攀升到11.5%,其中肺炎克雷伯菌对该类抗生素的耐药率呈明显增长趋势,由2.9%增长至26.8%,需要引起重点关注。CRE在多种环境情境下产生并传播,除了临床领域外,养殖业亦是重点关注的领域。目前,养殖环境中关于CRE的研究多聚焦于畜禽粪便和污水,而对养殖区地下水中CRE的流行情况尚信息不足。地下水作为养殖区动物和人类共同饮用水,在耐药菌（antibioticresistantbacteria,ARB）传播中发挥着至关重要的作用。近年来,国内外不断报道携带blaCTX-M、mcr-1、blaKPC和blaNDM的肠杆菌科细菌在地下水中检出,比如我国养殖区地下水存在携带blaKPC-2或blaNDM-1的解鸟氨酸拉乌尔菌以及携带blaNDM的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌的污染,但这些研究主要聚焦于小范围研究区域的单一畜种,属于定性研究且样本量代表性不足,无法回答我国典型养殖区地下水中CRE的污染现状,以及是否存在畜种差异性等问题。因此,不同养殖区域和不同畜种类型的养殖场地下水中CRE污染现状研究亟待开展,这是采取措施以遏制CRE传播的前提和基础。综上,基于我国养殖特点和布局,本论文选择中国北方的山东和内蒙古两个重要养殖省份开展研究,目的是调查井水中CRE的赋存特性、空间分布、耐药性及毒力特性,剖析我国北方典型养殖区的地下水中CRE的污染状况,探讨井水中CRE与养殖场动物粪便中CRE的转移规律和系统发育关系,为遏制养殖区CRE传播提供数据和理论支持。方法2019年8月,本研究于中国北方畜禽养殖地区6个县的226家养殖场（包括52家养鸡场、101家养猪场和73家养牛场）开展采样工作,共采集208份井水和273份动物粪便样品。首先进行井水中CRE的筛选与鉴定,而后对检出CRE的井水周边10 km养殖场的102个动物粪便样本进行CRE筛选。通过PCR和药敏试验分析耐药基因型和表型;通过S1-PFGE和Southern印迹染色确定质粒大小及碳青霉烯耐药基因是否在质粒上;通过二代基因组测序分析CRE分离株的耐药基因、毒力基因及碳青霉烯耐药基因的遗传环境。结果1.检出情况:从208份井水中共分离出18株CRE（5.3%,11/208）,有7和11株分别从6个山东井水（6.7%,6/89）和5个内蒙古井水（4.2%,5/119）中检出,有11株,3株和4株CRE分别检出于7个鸡场井水（15.9%,7/44）,3个猪场井水（3.1%,3/97）和1个牛场井水（1.5%,1/67）。从102份动物粪便中共检出21株CRE（12.8%,13/102）,分别来自9个鸡粪（34.6%,9/26）,2个牛粪（9.5%,2/21）和2个猪粪（3.6%,2/55）。从井水和动物粪便中检出的39株CRE包括肺炎克雷伯菌（n=13）、大肠杆菌（n=13）、塞氏柠檬酸杆菌（n=6）、肠杆菌（n=6）和密歇根克雷伯菌（n=1）;2.耐药特征与毒力特征:所有分离株均携带碳青霉烯耐药基因（blaNDM或blaKPC-2）且表现出多重耐药性,均对头孢噻肟、头孢他啶、四环素、环丙沙星、美罗培南和亚胺培南耐药。从养猪场和养牛场井水中首次检出携带blaKPC-2的ST11型肺炎克雷伯菌克隆株,具有含毒力基因簇（rmpA2-iucABCD-iutA）的IncHI1B/IncFIB（K）型毒力质粒,该质粒与临床上报道的高毒力质粒（pVir-CR-hvKP-C789,pVir-CR-HvKP4 和 pCR-HvKP1-VIR）具有87.0%的基因组覆盖度和99.9%的核苷酸一致性。3.与动物粪便CRE的关系:大部分菌株携带的碳青霉烯耐药基因位于可接合的质粒上,质粒大小范围为～46 kb-～500 kb,半数以上菌株携带的blaNDM位于约～46 kb的IncX3质粒上。基于单核苷酸多态性（SNP）构建系统发育树,在省内（同一县,不同县）和省间不同县共鉴定出6组具有高度同源性的菌株,其中1组为从内蒙古B县（3株分离自井水,1株分离自鸡粪）和相隔950km的山东F县（1株分离自井水）养鸡场中检出的含有blaNDM-7的IncX3质粒的ST895肺炎克雷伯菌。结论1.全部养殖场中5.3%的井水被CRE污染且检出存在菌属多样性;养鸡场井水CRE检出率最高,是养殖业CRE限控的重点对象。2.养猪场和养牛场井水检出临床相关的含IncHI1B/IncFIB（K）质粒的高毒力耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌,表明养殖业与医疗领域存在CRE的交叉传播现象。3.在不同肠杆菌科细菌中发现可转移且高度相似的含blaNDM的IncX3质粒,表明其在不同畜种类型养殖场井水-动物粪便中具有较高的水平基因转移潜力。4.在跨省的养鸡场井水和鸡粪中检出具有高度同源性的携带blaNDM-7的ST895肺炎克雷伯菌,表明blaNDM可通过克隆进行远距离跨介质传播,传播的驱动力及其原因需要进一步探讨。