【摘 要】
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成纤维细胞生长因子12（fibroblast growth factor 12,FGF12）是成纤维细胞生长因子家族的一员,在神经元、肥大细胞、心肌细胞等细胞中表达,参与癫痫性脑病,心律失常,动脉粥样硬化等疾病的发生。肺动脉高压目前被认为是仅次于冠心病和高血压的第三大常见心血管疾病,而FGF12可以作为肺动脉高压的诊断标志物。犬肺动脉高压的症状与人类相似,并呈现高发趋势,由于没有明显区别于其他疾病
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成纤维细胞生长因子12（fibroblast growth factor 12,FGF12）是成纤维细胞生长因子家族的一员,在神经元、肥大细胞、心肌细胞等细胞中表达,参与癫痫性脑病,心律失常,动脉粥样硬化等疾病的发生。肺动脉高压目前被认为是仅次于冠心病和高血压的第三大常见心血管疾病,而FGF12可以作为肺动脉高压的诊断标志物。犬肺动脉高压的症状与人类相似,并呈现高发趋势,由于没有明显区别于其他疾病的特征性症状或体征,因此诊断很困难。犬成纤维细胞生长因子12（Canis fibroblast growth factor 12,cFGF12）在犬肺动脉高压（PAH）的诊断治疗中可能发挥着重要作用,目前,有关cFGF12的研究未见报道。本研究利用生物信息学软件对cFGF12蛋白进行了结构分析及进化树构建;构建原核表达载体p EASY-Blunt E1-cFGF12,对cFGF12蛋白进行可溶性分析,进行诱导条件优化及亲和层析纯化,利用NIH3T3细胞验证cFGF12蛋白的生物学活性;通过对新西兰大白兔进行免疫获得高效价的抗血清,纯化后制备出具备特异性的cFGF12多克隆抗体。本研究不仅为大量获得cFGF12的可溶性蛋白提供了方向,并且对于犬PAH的临床诊断及治疗开拓了广阔的市场应用前景。主要研究结果如下:1.cFGF12的生物信息学分析,表明cFGF12是一种不具有信号肽和跨膜结构的亲水性蛋白质,理论分子质量为20.424 KDa,具有8个N糖基化位点26个磷酸化位点,亚细胞定位在细胞质中,二级结构由α-螺旋,β-转角和无规卷曲组成;进化树分析结果表明cFGF12与h FGF12的亲缘关系最近。2.本研究构建pEASY-Blunt E1-cFGF12原核表达载体并进行原核表达,可溶性分析结果发现cFGF12是一种大小为21 KDa的可溶性蛋白。该蛋白的最优诱导条件为添加0.1m M IPTG,在37℃诱导2 h。通过对该蛋白进行Ni-NAT亲和层析纯化,获得大小为21KDa的cFGF12蛋白。CCK8方法证明了cFGF12蛋白具有促进NIH3T3细胞增殖的生物学活性。3.本研究利用纯化后cFGF12蛋白作为抗原对新西兰大白兔进行四次免疫,间接ELISA法测定抗血清效价达到1:10~6。利用Protein A对血清进行纯化,SDS-PAGE法鉴定其纯度;利用真核质粒p CMV13-His-cFGF12转染HEK293细胞用于多克隆抗体的特异性鉴定;Western Blot法确定了cFGF12多克隆抗体能够特异性识别cFGF12蛋白,具有良好特异性。
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