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温度胁迫能够造成机体的自由基代谢紊乱,损害机体细胞和组织正常的生理功能和免疫防御能力,影响动物新陈代谢、生长、发育、免疫、生殖等,严重可导致动物死亡。凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是世界上主要的对虾养殖种类之一。温度是凡纳滨对虾养殖的重要影响因素之一。本论文以凡纳滨对虾为研究对象,以课题组已有的高、低温胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺组织的转录组测序数据为基础,分析获得与抗高、低温胁迫相关的候选基因,通过实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,q RT-PCR）对这些基因在受温度胁迫的凡纳滨对虾体内表达水平进行了探究,使用荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization,FISH）对基因的功能和表达定位进行分析。主要研究内容如下:1、高温胁迫下凡纳滨对虾Luc7L、PUF、ddit4l基因的表达特征从高温渐变和高温骤变的转录组数据中筛选出Luc7L、PUF、ddit4l三个候选基因,基于凡纳滨对虾全基因组数据（NCBI,ASM378908v1）中的参考序列,采用直接PCR扩增,分别获得三个基因的部分c DNA（完整的ORF和部分UTR）序列。Lv-Luc7L基因包含一个1200 bp的ORF,可编码399个氨基酸,在22～264位置含有LUC7超基因家族的保守结构域;Lv-PUF基因包含一个1890 bp的ORF,可编码629个氨基酸,在40～629位置含有half-pint超基因家族的保守结构域,在131～204、28～301以及533～615位置有三个RRM的功能结构域;Lv-ddit4l基因包含1个495 bp的ORF,编码164个氨基酸,在62～160氨基酸位置处包含一个RTP801C超基因家族功能结构域,且该结构域在物种间相当保守。对以上三个基因编码的氨基酸序列进行同源序列比对,发现均与虾蟹类的同源性较高:Lv-Luc7L与斑节对虾（Penaeus monodon）、日本囊对虾（Penaeus japonicus）的同源性最高,均为95.00%;Lv-PUF与斑节对虾的同源性最高,为80.78%;Lv-ddit4l与北太平洋雪蟹（Chionoecetes opilio）的同源性较高,为59.76%。对以上三个基因进行系统进化分析,结果显示都与甲壳类动物亲缘关系较近。高温胁迫实验分为高温渐变和高温骤变两种。其中高温渐变胁迫过程如下:凡纳滨对虾在26℃（对照）恒温养殖之后,以每12 h升温2℃的速度从26℃升温至38℃,38℃维持12 h后,再以每12 h降温2℃的速度回温至26℃。取样时间分别为:A-26℃组:常温26℃养殖时;B-32℃组:从26℃升温至32℃后12 h;C-38℃组:从32℃升温至38℃后12 h;D-32℃组:从38℃回温至32℃后12 h;E-26℃组:从32℃回温至26℃后12 h。高温骤变胁迫过程如下:在26℃（对照）恒温之后,将凡纳滨对虾直接从26℃海水中移至36℃海水中养殖24 h,再将凡纳滨对虾直接从36℃海水中移至26℃海水中养殖48 h。取样时间分别为:F-36℃（10 min）组:从26℃海水中移至36℃海水中后10 min;G-36℃（24 h）组:从26℃海水中移至36℃海水中后24 h;H-26℃组:从36℃海水中移至26℃海水中后48 h。利用q RT-PCR技术分析Luc7L、PUF、ddit4l三个基因在上述高温胁迫过程中5个不同组织（眼柄、鳃、肝胰腺、神经和肌肉）的表达情况,结果显示,在26℃水温环境（A-26℃）中,Lv-Luc7L、Lv-PUF和Lv-ddit4l在凡纳滨对虾5种组织中均有表达,且表达量基本相同,没有显著差异（p＞0.05）。在水温缓慢升至38℃（C-38℃）时,眼柄、鳃、肝胰腺、神经、肌肉5种被检组织中Lv-Luc7L表达量均显著上调（p＜0.05）。在36℃范围内的整个温度骤变过程中,Lv-Luc7L在鳃、肝胰腺、神经和肌肉中表达量均显著上调（p＜0.05）。在高温渐变到最高温（C-38℃）时,鳃、肝胰腺、神经、肌肉中Lv-PUF表达量均显著上调（p＜0.05）。随着温度缓慢上升,肝胰腺、神经和肌肉中的Lv-Luc7L、Lv-PUF表达量上升,且在温度回温时基因表达量又恢复。在整个36℃的温度骤变过程中,肝胰腺中Lv-PUF基因的表达量都有显著变化。在32℃～38℃范围内（B-32℃、C-38℃、D-32℃）的整个温度渐变的过程中,Lv-ddit4l在眼柄、鳃和肝胰腺中均有表达量显著上调（p＜0.05）;在36℃范围内的整个温度骤变过程中,Lv-ddit4l在鳃、肝胰腺、神经和肌肉中表达量均显著上调（p＜0.05）,同时骤变早期肝胰腺中的表达量变化为最高。通过荧光原位杂交的方法探究在正常温度（A-26℃）和高温骤变早期（F-36℃10 min）胁迫下的凡纳滨对虾肝胰腺中ddit4l基因的分布情况。结果显示,ddit4l基因表达主要定位在细胞核的位置,在常温组中表达水平较低,在高温骤变早期表达水平显著上升。2、高温胁迫下凡纳滨对虾HSP70基因的荧光原位杂交根据课题组已有HSP70基因的表达定量结果可知:在高温渐变中,在水温缓慢升至38℃（C-38℃）时,Lv-HSP70基因的表达量显著上调;在高温骤变中,骤变到36℃早期（F-36℃10 min）时基因上调表达极显著（p＜0.01）。荧光原位杂交结果显示,HSP70定位在细胞质和细胞核中。在正常情况下只少量存在于细胞质中,而在受到高温渐变胁迫时,HSP70表达增多且核内转录本的表达量呈现增加的趋势;在受到高温骤变胁迫时,细胞质中的HSP70表达增多。3、低温胁迫下凡纳滨对虾MPPED2基因的表达特征从低温渐变和低温骤变的转录组数据中筛选出MPPED2候选基因,基于凡纳滨对虾全基因组数据（NCBI,ASM378908v1）中的参考序列,直接PCR扩增得到MPPED2部分c DNA（完整的ORF和部分UTR）序列。Lv-MPPED2基因包含一个834 bp的ORF,可编码277个氨基酸,预测其在134、165和244位置含有3个N-糖基化位点,在52～246位置含有MPP＿239FB超基因家族的保守结构域。对MPPED2基因编码的氨基酸序列进行同源序列比对,发现LvMPPED2与斑节对虾的同源性最高,为89.17%,其次是日本对虾,同源性为87.27%。对该基因进行系统进化分析,发现凡纳滨对虾先与斑节对虾紧密聚为一支,再与日本对虾相聚,它们的亲缘关系最近,形成一个独立的分支。低温胁迫实验分为低温渐变和低温骤变两种。其中低温渐变胁迫过程如下:凡纳滨对虾在26℃（对照）恒温养殖之后,以每12 h降温2℃的速度从26℃降温至10℃,10℃维持12 h后,再以每12 h升温2℃的速度回温至26℃。取样时间分别为:a-26℃组:常温26℃养殖时;b-18℃组:从26℃降温至18℃后12 h;c-10℃组:从18℃降温至10℃后12 h;d-18℃组:从10℃升温至18℃后12 h;e-26℃组:从18℃回温至26℃后12 h。其中低温骤变胁迫过程如下:在26℃（对照）恒温之后,将凡纳滨对虾直接从26℃海水中移至14℃海水中养殖24 h,再将凡纳滨对虾直接从14℃海水中移至26℃海水中养殖48 h。取样时间分别为:f-14℃（10 min）组:从26℃海水中移至14℃海水中后10 min;g-14℃（24 h）组:从26℃海水中移至14℃海水中后24 h;h-26℃组:从14℃海水中移至26℃海水中后48 h。利用q RT-PCR技术分析MPPED2基因在低温实验过程5个不同组织（眼柄、鳃、肝胰腺、神经和肌肉）的表达情况。结果显示在26℃水温环境（a-26℃）中,Lv-MPPED2在凡纳滨对虾5种组织中均有表达,且表达量基本相同,没有显著差异（p＞0.05）。鳃、肝胰腺中的Lv-MPPED2表达量在水温缓慢降至10℃最低温时（c-10℃）显著上调（p＜0.05）,在水温缓慢回温至18℃时（d-18℃）,眼柄、鳃、肝胰腺、神经、肌肉中Lv-MPPED2表达量均显著上调（p＜0.05）。眼柄、鳃、肝胰腺和肌肉中的Lv-MPPED2表达量在低温骤变晚期时显著上调（p＜0.05）,其中肝胰腺的差异最显著。通过荧光原位杂交的方法探究在正常温度（a-26℃）、低温渐变（c-10℃）、低温骤变晚期（g-14℃24 h）胁迫下的凡纳滨对虾肝胰腺中MPPED2基因的分布情况。结果显示,MPPED2基因表达主要定位在细胞核的位置,在常温组中表达水平较低,在低温渐变和低温骤变早期表达水平显著上升。