研究背景和目的应用自体脂肪移植已有上百年的历史,最初为块状或带蒂移植,用于全身各个部位软组织凹陷与缺损的填充。随着脂肪抽吸技术的问世,使得颗粒脂肪注射移植技术成为可能,由于其来源丰富、取材容易、操作简单、安全无排异反应、外形自然、手感柔软等优点,近年来广泛应用于整形美容外科领域,如面部畸形、凹陷性瘢痕、皱纹、外伤后缺损、声带麻痹等,其中具有代表性的是隆乳和面部年轻化的软组织填充。然而,颗粒脂肪移植后的高吸收活率和各种并发症如钙化、坏死、硬化结节和液化囊肿等限制了该颗粒脂肪注射移植技术在临床的广泛开展。因此,如何提高颗粒脂肪移植术后成活率,从而控制远期填充效果,成为整形外科临床应用及基础理论研究中的重大难题之一。近十余年来众多学者针对脂肪供区选择、脂肪获取方法、脂肪纯化方式、脂肪注射方式等方面,从细胞因子治疗、基因治疗及细胞治疗等多角度进行了大量研究,以提高移植脂肪的成活,尽管上述种种方法在促进移植物血管新生、预防或减轻纤维化、提高成活率方面取得了一定的效果。以往研究显示,脂肪组织有着相当丰富的血液供应,每个脂肪细胞都有单独的血管供应系统与主干相连以保证每个脂肪细胞的营养供应,形成类似葡萄串样的结构。在颗粒脂肪注射移植过程中脂肪的获取、收集以及注射等对脂肪细胞以及供应血管构成损伤,仅残留少部分的血管片段,严重影响到移植物的血液供应。此外成熟的脂肪细胞内含有一大脂肪滴,少量细胞器被挤向边缘,特殊的细胞结构决定了脂肪细胞的高耗能性,成熟的脂肪细胞很容易因缺血缺氧而发生坏死,从而影响移植脂肪的成活。颗粒脂肪移植早期移植物尚未与受区建立良好的血液供应时,缺乏有效的血液供应而处于缺血缺氧状态,脂肪移植物仅通过周围组织的血浆灌注获取氧及营养,直至内部血管化的形成及与毛细血管的连接建立。然而组织间液的渗透能力只有约150-200微米,在此渗透范围以外的脂肪细胞应该大部分发生坏死,但是对脂肪移植的长期标本观察发现,脂肪移植物最终存活下来的区域并不仅限于由外周往内部的150-200微米内。这一结果提示在脂肪移植的后期过程中,存在着脂肪组织的新生与血运的重建。我们课题组前期实验发现,颗粒脂肪移植后血运重建主要是由宿主来源的新生血管长入而成,移植物绝大部分区域的细胞为宿主来源,因此宿主也就是受区的血管化条件、细胞再生条件在移植物成活过程中发挥着重要作用。目前对不同受区脂肪移植成活率的研究尚存有争议,1996年Guerrerosantos首先在大鼠肌肉内进行脂肪移植获得成功。Karacaoglu进行了兔皮下、肌肉上、肌肉下脂肪移植的比较,发现6个月后咬肌上保存率约82%,其认为可以通过选择受区来提高脂肪移植的存活。但Rieck则发现移植脂肪的成活率为皮下30%,肌肉内6%,肌肉内注射并不增加成活,原因可能是肌肉间空隙小、张力大,虽然肌肉中血供丰富,但活动时肌肉收缩挤压移植脂肪,反而影响血供。临床方面,Yoshimura等认为,胸大肌前后间隙血管丰富且利于乳房塑形,故此两层次均适合注射脂肪,面部脂肪移植最佳的注射层次可能包括皮下脂肪和肌肉层。Coleman等认为,不仅在胸大肌前后间隙,在胸大肌内亦适合注射脂肪。李青峰认为脂肪组织间的脂肪颗粒移植较其他部位有更高的存活率,受区组织生理同源性环境有利于移植脂肪的成活。究竟皮下、脂肪内和肌肉内何为颗粒脂肪移植的最佳受区,目前尚无定量的实验证实；对于不同移植部位所导致的成活率差异仍缺乏进一步的研究。基于以上科学问题,本实验将带有绿色荧光小鼠的颗粒脂肪分别注射移植到普通C57小鼠的背部皮下、股二头肌肌肉内及腹股沟脂肪垫内,观察不同组织层次移植脂肪的生存状况,从而选择最佳的脂肪移植受区。明确这个问题对提高脂肪移植成活率有着重要的意义。方法采用两种近交系小鼠,将由GFP小鼠获取的双侧腹股沟脂肪剪碎,通过16-gauge针头将其分别注射移植到C57小鼠的双侧背部皮下、股二头肌肌肉内及腹股沟脂肪垫内,每个注射点注射量为0.1ml。实验分为三组(每组35只)：皮下组(subcutaneous);肌肉内组(intramusculary);脂肪内组(fat pad)。1、湿重测量取0.1ml GFP鼠腹股沟粉碎脂肪称重,做为之后脂肪移植物湿重基线,注射后每组分别于1、4、8、12、16周(W)处死小鼠各7只取材,并再测湿重(n=7)。得出移植物的湿重保存率。2、组织学观察,毛细血管密度测量和结缔组织定量将三组获取的脂肪组织HE染色,切片显微镜观察、数码相机拍照。40倍镜下观察每个HE切片20个视野中毛细血管数,评估新生血管形成。3、GFP表达和CD34、Ki67免疫组化染色荧光显微镜观察冰冻切片绿色荧光表达。每个移植物100倍镜下合成完整图像,使用ImageJ软件测定GFP阳性所占总面积的百分比,了解移植物中移植物来源组织所占比例。选取颗粒脂肪移植后4W的组织,进行CD34、Ki67免疫组化染色以比较组织内CD34阳性前体细胞数量,从而探讨组织再生能力。4、统计学处理数据以均数±标准误(x±SEM)表示,使用统计软件SPSS 13.0进行数据处理。所有数据采用重复测量方差分析,如果差异显著同一个时间点三组之间采用独立t检验；每组不同时间点的差异采用单向方差分析(ANOVA),P值<0.05有统计学意义。结果1、大体观察：1W时3组移植物表面均可见包膜形成,大体观察无明显差异。8W时脂肪内组体积稍大于其他两组,16W时脂肪内组移植物体积明显大于其他两组移植物,且外观上更接近正常脂肪。移植物的湿重保存率：三组移植物保存率均在移植后出现了明显的下降,1-8W下降最为明显,8-16W保存率趋于平稳。脂肪内组保存率第8周起即明显高于皮下组及肌肉内组(P<0.05),16W皮下组保存率明显高于肌肉内组(P<0.05)。2、组织学观察：皮下组内脂肪坏死区域较多,肌肉内组最小。4W脂肪内组及肌肉内组移植物表现出更好的血管化和小体积脂肪细胞,至16W脂肪内组及肌肉内组移植物组织结构十分接近正常脂肪组织,但肌肉内组中成熟脂肪细胞的直径明显小于其他两组。半定量测量：三组移植物的血管密度及血管化结缔组织面积变化类似,移植后4周达到高峰,4W后较为缓和下降。肌肉内组中的血管密度在移植后4周起即明显高于其他两组。结果提示肌肉内移植物血管化最好,而长期观察脂肪垫内移植物成脂效果最好。3、三组移植物GFP阳性的区域随时间逐渐减少,且集中于移植物外围,半定量荧光面积在移植后1-8W下降明显,8-16W缓和下降。肌肉内组中的荧光面积比率从第4周开始即一直高于其余两组(P<0.05)。皮下组及脂肪内组在各个时间点均无统计学差异。结果提示三组移植物外围均可见来源于移植物的脂肪细胞存活,肌肉内移植物来源脂肪细胞存活率最高。4WCD34、Ki67免疫组化染色,脂肪垫移植物内有增殖活性的(Ki67表达阳性)CD34阳性细胞数量较多。讨论Yoshimura等近期的研究指出,脂肪移植后的保存并非简单的存活或替代,而是一种混合的保存方式：存活区(最外层)、坏死区(中央层)、再生区(外层和中央层之间),即移植物外层存活,内层被ASCs参与的组织再生所取代,中央坏死区域被吸收或形成油囊,油囊的存在一定时间内起到支架作用,使移植物保留一定的体积。因此,影响移植物远期保存的两个根本因素为源自移植物组织的存活以及组织再生状况。我们的实验结果显示肌肉内移植的脂肪有着更好的血管再生和血管化纤维结缔组织含量,在脂肪移植早期移植物依靠周围组织的血浆灌注和营养供应来保证存活,肌肉内丰富的血供特性增加了移植物的营养供应,从而肌肉内脂肪移植有更多移植物组织存活。我们进一步的实验结果显示肌肉内有更大的GPF阳性移植物来源的生存区域,证明了以上分析。然而有趣的是,湿重测量显示脂肪垫内最终成活率最高,而在血管环境最好的肌肉内最终成活率最低。其原因何在?我们认为可能有两个原因,第一,Yoshimura等研究提示正常脂肪细胞耐受缺血缺氧能力很差,仅有移植物外围小于300μm的范围内的脂肪细胞通过吸收渗透组织液的营养来度过缺血缺氧期,超过此有效距离的脂肪细胞大都坏死,接着在耐受缺血缺氧能力强的脂肪干细胞/间质细胞/祖细胞启动下新生的脂肪细胞替换死亡的脂肪细胞,脂肪移植后期成熟的脂肪细胞主要来源于干细胞启动的再生。远期脂肪移植成活率是由之后的脂肪再生决定的,肌肉内脂肪移植物中虽然有一定的移植物来源组织存活,但在移植物长期体积保存中所占比例较少,对远期体积保存的最终结果影响较少。第二,组织来源或宿主来源干细胞/祖细胞(如ASCs)在脂肪移植后脂肪再生中发挥着重要作用。有研究表明微环境决定了ASCs的命运和活性,脂肪垫内含有大量ASCs以及各种细胞所分泌的了促进成脂的因子,能为移植物提供一个适当的成脂微环境,这是脂肪移植后脂肪再生的关键。ASCs的分化依赖于微环境,通过适当地控制化学和力学环境ASCs可以成为特异表达和优先发展趋势的脂肪细胞系。肌肉内注射为脂肪移植提供足够的血液供应,但并不能提供一个适当的脂肪形成的微环境。这可在一定程度上解释了为什么即使有良好的血液供应,肌肉内注射仍表现为较差的移植成活率。机械力引起的肌肉运动有可能抑制ASCs的成脂分化。有研究指出,游离脂肪加上肉毒素A联合注射,可以显著降低脂肪移植重吸收水平。脂肪组织的各种细胞,特别是ASCs,是有力学敏感性的。有研究发现静态拉伸或低应力可以促进脂肪生成。然而动态机械力例如：循环拉伸或振动和静态压缩抑制脂肪生成。不仅机械力可以影响分化,而且基质硬度直接针对性影响间充质干细胞的分化。这或许可以解释16W时为什么肌肉内脂肪移植成熟脂肪细胞直径与其它两组相比显著偏小,肌肉内脂肪移植成活率低可能部分与肌肉运动有关。同样的我们发现脂肪垫内与皮下层脂肪移植后移植物毛细血管密度没有明显差异,但脂肪垫内脂肪移植物比皮下层有更好的成活率。不同受区脂肪移植成活率的差异有可能是不同的生物、化学和物理微环境所导致,微环境可能在脂肪再生中发挥着关键性的作用。结论1、脂肪内颗粒脂肪移植有较好的血管新生,能有效诱导脂肪再生,因此有最好的长期湿重保存率,脂肪内是最佳的脂肪移植受区选择。2、肌肉内血供丰富,有利于移植脂肪的存活,但肌肉持续性运动可以抑制脂肪细胞的成脂分化,导致长期保存不佳。3、受区的微环境可能是影响脂肪移植成活的重要因素。