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肥胖症是世界性的公共健康问题，是心血管疾病、2型糖尿病等代谢性疾病的高危因素。胰岛素抵抗是肥胖相关的代谢性疾病发生发展的病理生理基础。肥胖相关的慢性炎症，是内脏脂肪、肝脏及肌肉发生胰岛素抵抗的始动因素。FOXO1是受胰岛素信号负性调节的转录因子，通过调控其靶基因，参与调节肝脏的糖异生、极低密度脂蛋白合成、氧化应激以及凋亡等功能。近来报道FOXO1可在巨噬细胞中上调IL-1β的表达，在脂肪细胞中上调MCP-1及IL-6的表达，提示FOXO1可能是联系胰岛素信号与促炎细胞因子表达的桥梁。动物及临床研究显示，单纯脂肪肝向脂肪性肝炎发展过程中，肝脏FOXO1的表达水平显著增强。然而，在胰岛素抵抗的肝细胞中，FOXO1与促炎细胞因子表达的关系尚不清楚。肥胖导致的异位脂质沉积，可导致肝脏、肌肉等组织产生慢性炎症及胰岛素抵抗。脂代谢紊乱导致的巨噬细胞脂毒性，可诱导抗炎型巨噬细胞(M2)向促炎型巨噬细胞(M1)转化。内脏脂肪组织中巨噬细胞浸润及M1/M2比例增高，是肥胖相关的脂肪组织慢性炎症增强的重要原因。CGI-58是近来报道的甘油三酯水解的激活蛋白，广泛表达于全身各组织细胞。其基因突变在人群中导致Chanarin-Dorfman综合征，表现为多个组织脏器的中性脂肪沉积。巨噬细胞中CGI-58在自身脂代谢、全身慢性炎症及胰岛素抵抗中的作用，目前尚未见任何报道。【研究目的】1.在胰岛素抵抗的小鼠肝脏中考察FOXO1与慢性炎症的相关性，并在体外胰岛素抵抗的肝细胞模型上探讨FOXO1对促炎细胞因子表达的影响及其调控机制；2.在巨噬细胞CGI-58特异性敲除的小鼠模型上考察巨噬细胞CGI-58敲除对自身及全身脂代谢、全身慢性炎症及胰岛素抵抗的影响及其机制。【研究方法】1.在db/db肥胖小鼠模型及高脂喂养诱导的肥胖小鼠模型的肝脏中，应用RT-PCR、real-time PCR、WB及ELISA等方法检测FOXO1的表达活性与促炎细胞因子的表达水平；并在体外的胰岛素抵抗肝细胞模型中，上调或者下调FOXO1的表达活性，考察FOXO1对促炎细胞因子表达水平的影响；应用报告基因分析、ChIP等实验方法，深入探讨FOXO1对CCL20基因的转录调控机制。2.构建巨噬细胞CGI-58特异性敲除(MaKO)的小鼠模型，检测腹腔巨噬细胞、肝脏、脂肪及血浆的脂质代谢情况；应用GTT、ITT、急性胰岛素注射及高胰岛素-正常葡萄糖钳夹实验检测MaKO及对照小鼠的胰岛素敏感性；应用定量RT-real-time PCR、ELISA等方法检测高脂喂养的MaKO小鼠内脏脂肪、肝脏及全身的促炎细胞因子表达水平；应用内毒素刺激，考察了原代分离的CGI-58缺失的腹腔巨噬细胞及MaKO小鼠的促炎细胞因子表达水平；应用定量RT-real-time PCR、WB、GTT、ITT等方法检测抗氧化剂NAC对巨噬细胞CGI-58敲除诱导的慢性炎症及胰岛素抵抗的影响。【研究结果】1. FOXO1在肝脏胰岛素抵抗相关的慢性炎症中的作用1.1首先在肥胖胰岛素抵抗的小鼠血浆及肝脏中，检测了FOXO1表达水平与促炎因子及炎细胞浸润的相关性。结果显示：30周龄的db/db小鼠与同窝的杂合子db/+及WT小鼠相比，其体重、空腹血糖及胰岛素水平显著升高；其肝脏有大量脂质沉积，且巨噬细胞、T细胞浸润增加；其肝脏MCP-1、IL-1β、IL-6、iNOS及CCL20等促炎细胞因子表达水平升高；其肝脏FOXO1的表达显著升高；高脂喂养诱导的C57/B6肥胖小鼠，其肝脏MCP-1、IL-1β、IL-6及iNOS等促炎细胞因子表达水平升高，同时FOXO1的表达与活性均显著升高。1.2进一步在胰岛素抵抗的肝细胞中观察了FOXO1表达水平对炎症因子基因表达的影响。结果显示：低剂量的TNF-α长时间处理HepG2细胞，可显著抑制胰岛素刺激的AKT及IRS-1磷酸化，胰岛素刺激的FOXO1磷酸化受到抑制，表明细胞内胰岛素抵抗(信号受损)模型的建立成功；TNF-α可促进HepG2细胞中p65的核转位，并升高MCP-1、IL-1β及IL-6等促炎细胞因子的mRNA水平；应用特异的小干扰RNA将HepG2细胞中FOXO1的表达水平敲低，可显著抑制TNF-α诱导的MCP-1、IL-1β及IL-6的mRNA水平。1.3为了深入探讨FOXO1调控促炎因子表达的机制，我们以T淋巴细胞趋化因子CCL-20为靶标，采用基因转染结合启动子报告基因分析方法进行了观察，结果显示：肝细胞中表达组成活性的FOXO1可增强TNF-α诱导的CCL20mRNA及蛋白分泌水平，而沉默内源性FOXO1表达得到相反的结果；我们进一步发现FOXO1可增强TNF-α诱导的CCL20启动子活性，其活性区域位于CCL20启动子转录起始位点上游-108~-31区域；进一步构建位点特异性突变分析表明，CCL20启动子上的NF-κB元件(-81~-70)在FOXO1联合TNF-α对CCL20进行调控中起作用；最后经ChIP实验证实，FOXO1可促进p65/p50异二聚体与CCL20启动子上的NF-κB (-81~-70)元件相结合，促进CCL20的转录和表达。1.4为了考察FOXO1促进CCL-20表达的功能意义，我们采用Boyden小室迁移实验观察了TNF-α处理的HepG2细胞培养上清对人血液单核细胞(PBMC)迁移的影响。结果表明，在此基础上高表达组成活性的FOXO1可进一步增强PBMC的迁移活性；而沉默FOXO1的表达可抑制TNF-α对PBMC迁移的诱导作用；而CCL20抗体可在显著抑制TNF-α及FOXO1刺激的PBMC趋化功能。2.巨噬细胞CGI-58在脂代谢、慢性炎症及胰岛素抵抗中的作用2.1首先，我们对巨噬细胞特异的CGI-58基因敲除(MaKO)小鼠的腹腔巨噬细胞及肝脏、脂肪和血浆脂质水平进行了鉴定。结果显示：(MaKO)小鼠巨噬细胞内大量脂质沉积，脂质谱分析表明甘油三酯(TG)水平显著升高，而一些特殊种类的神经酰胺(Ceramide)、磷脂酸(PA)及磷脂酰肌(PI)水平降低；正常饮食的MaKO小鼠较之fl/fl对照小鼠，其肝脏TG水平降低，血液TG水平升高；小鼠巨噬细胞CGI-58敲除导致高脂饮食的小鼠肝脏总胆固醇(TC)水平降低。2.2其次，我们观察了不同年龄阶段的MaKO小鼠全身胰岛素敏感性的状态。结果发现：高脂饮食(HFD)或者正常饮食(CD)16周的MaKO小鼠与fl/fl对照小鼠相比，体重、空腹及餐后血糖水平无基因型相关的差异；MaKO-HFD组较fl/fl-HFD组空腹及餐后胰岛素水平及HOMA-IR指数显著升高；GTT及ITT实验提示MaKO-HFD组较fl/fl-HFD葡萄糖耐量及胰岛素耐量均受损；急性胰岛素注射实验表明MaKO-HFD组较之对照组小鼠，其胰岛素刺激的内脏脂肪、肌肉及肝脏中AKT磷酸化水平受损；进一步，在35周HFD的小鼠上进行的高胰岛素-正常葡萄糖钳夹实验表明：MaKO组的小鼠的葡萄糖输注率显著降低。这些结果表明：巨噬细胞CGI-58敲除加重了HFD诱导的全身胰岛素抵抗。2.3进一步我们观察了MaKO小鼠血浆、肝脏、脂肪等组织细胞中炎症因子的表达情况。结果显示：16周HFD的MaKO组小鼠较之对照组：其血浆TNF-α、IL-6及IL-18水平显著升高；其肝脏及内脏脂肪组织中炎性细胞浸润增强，并伴随着TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子的mRNA表达水平升高；流式细胞术表明其内脏脂肪组织的血管间质细胞浸润增多，M1型巨噬细胞、B细胞及T细胞数量增多，而巨噬细胞总量及单核细胞总量无明显差异；原代分离的内脏脂肪细胞及脂肪组织中的巨噬细胞的IL-1β mRNA水平升高。这些结果表明：巨噬细胞CGI-58敲除加重了HFD诱导的全身慢性炎症。2.4为了考察CGI-58基因敲除对巨噬细胞炎症反应性的影响，我们分离了原代MaKO小鼠腹腔巨噬细胞，经LPS刺激后，观察了炎症因子的表达情况。结果显示：与对照组相比IL-1β表达和分泌特异性升高；CD或者HFD8周的MaKO小鼠经腹腔注射LPS刺激30分钟后，较之对照组，其血浆IL-18水平升高，而IL-6、TNF-α等促炎细胞因子的水平无差异。2.5为了进一步探讨IL-18和IL-1β特异性升高的机制，我们检测了IL-18和IL-1β的上游炎性体信号通路。结果表明：MaKO小鼠来源的腹腔巨噬细胞较之对照组，LPS刺激的Nlrp3mRNA水平显著升高；16周HFD的MaKO小鼠较之对照组，其附睾脂肪、肝脏、附睾脂肪来源的巨噬细胞中Nlrp3的mRNA水平显著升高；在基础或者LPS刺激下，MaKO小鼠来源的腹腔巨噬细胞较对照组Caspase1活性均显著升高。这些结果提示：巨噬细胞CGI-58敲除激活了Nlrp3相关的炎性体信号通路。2.6为探索巨噬细胞CGI-58敲除激活炎性体的机制，我们检测了巨噬细胞中炎性体的活化信号活性氧(ROS)产生情况。结果表明：MaKO小鼠来源的腹腔巨噬细胞活性氧产生增加，并可被抗氧化剂NAC阻断，进而降低Caspase1的活性，抑制IL-1β的分泌；腹腔巨噬细胞与附睾脂肪体外共培养实验表明：在LPS刺激下，MaKO来源的腹腔巨噬细胞较之对照组，显著增强了脂肪组织的JNK及NF-κB炎症信号，并进一步抑制胰岛素刺激的AKT磷酸化水平，而这一作用可被抗氧化剂NAC阻断。这些体外实验表明：CGI-58缺失的巨噬细胞经ROS-Caspase1途径促进IL-1β分泌，进而增强内脏脂肪的炎症及胰岛素抵抗。2.7进一步我们在动物水平验证了MaKO小鼠巨噬细胞中ROS介导的炎性体激活在加重全身慢性炎症及胰岛素抵抗中的作用。结果表明:16周高脂喂养的MaKO小鼠较之对照组小鼠，其葡萄糖及胰岛素耐量均受损，而给予4周NAC喂养可显著改善MaKO组及对照组的糖耐量及胰岛素耐量，并消除基因型之间的差异；NAC喂养后，高脂喂养的MaKO组较之对照组血浆IL-18及TNF-α水平无差异，而IL-6水平显著降低；肝脏IL-6的mRNA水平降低，TNF-α、IL-1β等水平无差异；附睾脂肪的促炎细胞因子水平表达无差异；同时，炎性体相关基因Nlrp3及ASC的mRNA水平在肝脏和脂肪均无基因型相关的差异。这些结果表明：抗氧化剂NAC治疗可显著改善巨噬细胞CGI-58敲除加重的HFD诱导的全身慢性炎症及胰岛素抵抗。【主要结论】1. FOXO1在胰岛素抵抗的肝细胞中可增强促炎细胞因子的表达；可通过促进p65/p50异二聚体与CCL20启动子结合而增强肝细胞CCL20的表达和分泌，在胰岛素抵抗肝组织炎细胞浸润及炎症加重过程中可能具有重要作用。2.巨噬细胞CGI-58缺失可诱导活性氧产生，激活炎性体信号通路，促进IL-1β及IL-18的分泌，增强高脂诱导的全身慢性炎症，从而加重全身胰岛素抵抗。【研究意义】胰岛素抵抗的肝细胞中FOXO1增强促炎细胞因子及趋化因子基因表达的现象，为揭示胰岛素抵抗加重慢性炎症的分子机制提供了实验证据。巨噬细胞CGI-58与全身慢性炎症及胰岛素抵抗关系的阐明，揭示了巨噬细胞脂质异常沉积主要通过ROS途径在慢性炎症及胰岛素抵抗发生中新的机制。FOXO1和CGI-58有望成为改善肥胖相关的慢性炎症及胰岛素抵抗的新靶标。