B7-1(又称CD80)分子是一种共刺激分子,主要表达于抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)表面,其受体为T淋巴细胞表面CD28家族分子,二者结合后可介导T细胞活化、增殖与分化,从而发挥机体的免疫效应。正常生理条件下B7-1分子表达稳定,为T细胞的活化提供协同刺激信号,维持T细胞的存活。当B7-1不表达或低表达的时候,将会导致T细胞的功能异常,致使T细胞无能或凋亡,导致机体患病。反之B7-1高表达又会使T细胞过度活化,引起自身免疫性疾病。自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病,主要表现为T、B淋巴细胞过度活化。系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种常见的自身免疫病,其中狼疮性肾炎又是SLE最常见和最严重的并发症,是导致SLE患者死亡的主要原因之一。大量研究表明,在SLE患者体内B7-1分子的表达明显高于正常人,提示B7-1/CD28协同刺激信号在SLE病理过程中发挥着重要作用。通过B7-1抗体封闭抗原提呈细胞表面的B7-1分子,从而阻断B7-1/CD28信号通路,降低机体的免疫应答。但传统的单克隆抗体由于鼠源性高,易引起人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody response,HAMA),限制了其应用。采用基因工程技术设计的嵌合抗体是一种人源化的重组抗体,它是应用DNA重组技术将鼠源性单抗V区基因与人IgG的C区基因拼接后,插入适当载体,转染相应宿主细胞表达的抗体分子。嵌合抗体包含了鼠源Fab段与人源Fc段,人源化部分达到70%,大大降低了HAMA反应,延长了半衰期。此类抗体一方面具有鼠源性单抗Fab段高亲和力结合抗原的能力,另一方面其人源Fc段在患者体内又可介导ADCC效应、CDC效应及免疫调理作用。本课题在运用化学法建立小鼠狼疮样肾炎模型并对其进行生物学鉴定的基础上,运用自行研制的B7-1人鼠嵌合抗体对模型小鼠进行干预,通过免疫学、血清学、病理学等指标,探讨B7-1人鼠嵌合抗体阻断B7-1/CD28信号通路对小鼠狼疮样肾炎模型病理损伤的逆转效应,以期寻找针对该类疾病更加高效、安全、给药方便的抗体药物。一、b7-1人鼠嵌合抗体的制备及鉴定目的:制备b7-1人鼠嵌合抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:将表达b7-1嵌合抗体的细胞株大规模培养,收集上清;proteing亲和层析分离纯化抗体;流式细胞术分析嵌合抗体对人及小鼠细胞膜型b7-1分子的识别。结果:经proteing亲和层析柱分析纯化,lowry法定量,所得的嵌合抗体蛋白浓度为2.5mg/l;b7-1人鼠嵌合抗体与转人b7-1基因小鼠成纤维细胞株l929-b7-1、淋巴瘤细胞株daudi、小鼠脾脏细胞的识别率分别为95.1%,96.6%和51.7%。结论:b7-1人鼠嵌合抗体能够特异性的识别细胞膜表面b7-1分子。二、化学法建立小鼠狼疮样肾炎模型并对其进行生物学鉴定目的:在运用化学法建立小鼠狼疮样肾炎模型,并通过免疫学、血清学、组织形态学等指标对其进行生物学鉴定。方法:取6周龄雌性c57bl/6j小鼠,随机分为2组,模型组予一次性腹腔注射pristane0.5ml/只,空白对照组给予等体积的生理盐水。每2周检测一次血清中ana及抗dsdna抗体的滴度,每月定期检测小鼠的尿蛋白含量,流式细胞术分析脾脏中抗原提呈细胞、浆细胞、t细胞的活化程度,经he染色观察肾脏的病理学改变,免疫组织化学分析肾脏免疫复合物的沉积,透射电镜观察肾小球及基底膜的改变。结果:pristane诱导后,部分小鼠出现尿蛋白,随时间的延长,4个月时80%小鼠尿蛋白含量达到++~+++;2个月时,小鼠血清中抗dsdna抗体阳性率为60%,ana阳性率为90%;流式分析结果显示,模型组小鼠脾脏中吞噬细胞、树突状细胞、粒细胞的活化明显升高(p<0.05),b细胞膜表面cd21、cd80、cd86分子表达水平造模组明显高于对照组(p<0.05),模型组t细胞表面cd4、cd25、cd28、cd152分子表达明显高于对照组(p<0.05);肾脏he切片可见肾小球体积中重度增大,大量炎性细胞浸润及肾小管轻微充血,免疫荧光染色可见肾小球上有大量ic沉积;透射电镜观察肾小球致密物沉积明显,基底膜严重增厚。结论:成功建立pristane诱导的小鼠狼疮样肾炎模型。三、b7-1人-鼠嵌合抗体对小鼠狼疮样肾炎模型的免疫干预效应及分子机制的研究目的:探讨b7-1人-鼠嵌合抗体阻断b7/d28信号通路对小鼠狼疮样肾炎模型病理损伤的逆转效应。方法:按上述方法建立小鼠狼疮样肾炎模型,取成模小鼠随机分为3组,每组10只。抗体干预组用b7-1人-鼠嵌合抗体经眼眶后静脉给药,阳性对照组注射免疫抑制剂ctx,模型组注射人同型igg。每月定期检测尿蛋白含量、血清中ANA及抗dsDNA抗体滴度,干预至3个月时,处死小鼠,研磨脾脏经流式细胞术分析多种免疫相关细胞的活化,取肾脏进行HE染色分析,免疫复合物(IC)检测及透射电镜观察。结果:抗体干预后,尿蛋白浓度逐渐由++~+++降为±~++,同时血清中ANA和抗dsDNA抗体的荧光强度也明显降低,与模型组比较具有统计学差异(P<0.05)。流式结果显示,抗体干预组脾脏中吞噬细胞、树突状细胞、粒细胞的活化明显低于模型组(P<0.05),B细胞膜表面CD80、CD86分子表达水平模型组明显高于抗体干预组(P<0.05),T细胞表面CD4、CD25、CD152分子表达情况模型组高于抗体干预组,有统计学意义(P<0.05);肾脏HE染色结果显示,抗体干预组肾小球炎性细胞侵润及肾小管充血等表现均得到明显改善。免疫荧光染色可见抗体干预组抗原抗体复合物(IC)的荧光强度明显减弱。经透射电镜观察,抗体干预组与模型组相比,肾小球上的电子致密物沉积减少,基底膜厚度趋于均匀。结论:B7-1人鼠嵌合抗体通过抑制B7-1/CD28信号通路下调机体的免疫应答,减少自身抗体的产生,对自身免疫造成的病理损伤具有逆转作用。