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海藻糖是由两个D-吡喃葡萄糖以α1-α1糖苷键连接形成的非还原性二糖,在高温、寒冷、缺氧、干燥、脱水和营养匮乏等恶劣环境胁迫下,昆虫体内海藻糖能有效地稳定脱水酶,保护细胞膜和蛋白。本研究为海藻糖在提高昆虫抗逆性方面的研究提供理论基础。 基于高通量转录组数据筛选,从优雅蝈螽中克隆TPS和Tre基因cDNA全长。旨在研究模拟野外温度骤变和缓慢升降温驯化对优雅蝈螽 Gampsocleis gratiosa海藻糖合成酶(TPS)基因表达量、血淋巴海藻糖和总糖含量的影响和三者间的相关性,以及海藻糖水解酶(Tre)基因组织特异性表达。采取模拟野外温度骤变和缓慢升降温两种温度驯化策略,以热电偶温度计测得优雅蝈螽体温与环境温度最为接近的温度值作为最适温度,实时荧光定量PCR测定优雅蝈螽TPS不同温度表达和Tre表达的组织特异性,硫酸蒽酮法测定血淋巴海藻糖和总糖含量(以25℃最适温度作为对照)。 克隆得到一个TPS基因,一个水溶性海藻糖水解酶(Tre1)基因和一个类膜结合型海藻糖水解酶(Tre2-like)基因。TPS基因命名为GgTPS(GenBank登录号:KU578006),全长3225 bp,包含2430 bp的开放阅读框,5′-非编码区(5′-UTR)153 bp和3′-非编码区(3′-UTR)642 bp。共编码809个氨基酸,预测的蛋白分子量(Mw)91.35 ku,理论等电点(pI)6.28。两个Tre基因分别命名为GgTre1,GgTre2-like。分离到3个不同的GgTre1转录本(GenBank登录号:KY400001~KY400003),全长分别为2107,2021,1914 bp,5-UTR33 bp,3-UTR长度分别为322,248,129 bp。转录本1和转录本3编码区长度为1752 bp,编码583个氨基酸。蛋白分子量和等电点分别为67.88 ku和6.59。转录本2编码区长度1740 bp,编码579个氨基酸,蛋白分子量和等电点分别为67.29 ku和6.34。得到3个不同的GgTre2-like转录本亚型( GenBank登录号:KY400004~KY400006),全长分别为2491,2460,2381 bp,5-UTR284 bp,3-UTR分别为398,367,285 bp。开放阅读框1809 bp,编码602氨基酸,蛋白分子量和等电点分别为67.88 ku和6.59。 骤然降温阶段 TPS相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,在15℃最高,与最适温度25℃差异显著。海藻糖相对含量在0℃显著高于25℃。总糖相对含量在0℃和10℃显著高于25℃。骤然升温阶段,TPS相对表达量呈先降低后升高,再降低的变化趋势,40℃达到最高且与25℃差异显著。缓慢降温阶段 TPS相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,在15℃和20℃显著高于25℃;海藻糖含量表现出先降低后升高的变化趋势,0℃显著高于25℃,总糖含量在0℃、10℃和20℃与25℃差异显著。缓慢升温阶段TPS相对表达量呈先降低后升高的变化趋势,但与25℃无显著差异。海藻糖相对含量在40℃显著低于25℃。总糖相对含量呈先升高后降低的变化趋势,40℃和45℃显著高于25℃。不同温度驯化策略比较TPS相对表达量在15℃、40℃差异显著。海藻糖相对含量在40℃和45℃差异显著。总糖相对含量在10℃和20℃差异显著。体温在30℃差异显著。GgTre1在雌性卵巢和雄性附腺表达量最高。GgTre2-like在卵巢中高表达,在雄性肌肉和马氏管高表达。 实验结果表明,温度驯化能够提高昆虫的抗逆能力,昆虫体内TPS表达量和海藻糖合成量与其所处环境温度及作用时间密切相关。低、高温条件下TPS的表达和海藻糖的积累模式不同。基因组DNA序列表明2个GgTre基因3-UTR逐渐增长由可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)引起。GgTre2-like较GgTre1有相对稳定的表达趋势。两个GgTre基因表达的组织特异性不同。