口蹄疫是一种烈性传染病，通过空气传播，有广泛的动物宿主，并对人也有感染性，是受到广泛关注的人畜共患病之一。根据国际兽疫局(OIE)1996年文件规定，一旦口蹄疫暴发，所有感染和相接触的动物都必需屠杀。大量动物死亡以及因口蹄疫而引起其他无疫情国家的贸易壁垒将会给经济带来沉重的打击。因此，预防是解决问题的唯一办法。尽管传统的灭活苗已经在很多国家有效地控制了口蹄疫的发生，但是疫苗中灭活不完全的病毒又导致了疾病的暴发。科学家们曾试图用含有病毒表位的合成肽或细菌表达的蛋白制备亚单位疫苗。这些疫苗比灭活苗安全，可以诱导实验动物产生抗体有效地中和病毒，但不能有效地保护家畜抵抗病毒的攻击。然而，DNA疫苗提供了一种选择，因为它的免疫原性和安全性，特别是它不存在任何与活病毒可能相关的危险。 口蹄疫是由小RNA病毒科的口蹄疫病毒引起的。病毒颗粒由60个亚单位组成，每个亚单位包含各一分子的VP1，VP2，VP3和VP4，这4个分子组成了病毒壳蛋白P1。据报道，编码P1和病毒蛋白酶3C的非复制型DNA疫苗可以诱导产生抗病毒免疫应答。包含病毒全基因组的复制型DNA疫苗可以在易感细胞中复制，并可以产生更强的免疫应答。然而，在强毒攻击实验中，两种DNA疫苗对免疫猪的保护率只有20％。这可能是由于病毒蛋白酶3C和L抑制了宿主细胞的蛋白合成所致。据报道，这两个蛋白水解酶能水解宿主细胞的翻译起始因子eIF4A或eIF4G，其最终结果是导致细胞凋亡。 因此，科学家们将研究焦点集中在表位DNA疫苗上。最近的一篇报道显示编码口蹄疫病毒位点1的DNA疫苗对猪产生了100％的保护。位点1包括VP1上的141AA—160AA和200AA—213AA两个B细胞表位，是VP1上的优势位点，可以诱导动物产生免疫保护。除了位点1以外，现在已经在O型口蹄疫病毒粒子上发现了4个包含B细胞表位的位点。但是位点1与其他4个位点组合的DNA疫苗至今没有报道。这4个位点分别是位于VP1的位点3，包含40AA—60AA；位于VP2的位点2，包含70AA—78AA和131AA—134AA；位于VP3的位点4，包含56AA—58AA；以及位点5，只有一个氨基酸，即VP1上的149AA。 在本论文中，我们根据GeneBank中O型口蹄疫病毒序列(accession no.X00871)以及相对应的5个位点的序列和VP1上一个通用T细胞表位的序列设计并合成了多表位基因，命名为SG。采用含甘氨酸和丝氨酸的柔性接头以避免因表位直接连接而产生的相互干扰以及新表位的出现。用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ将SG克隆到DNA疫苗载体——pVAXI而获得pVAX一SG重组质粒。将pVAX一SG质粒DNA体外转染PKI细胞、BHK一21细胞或体内转染肌肉细胞，用抗O型口蹄疫病毒的阳性血清进行免疫组化检测，都能在转染细胞胞浆中发现明显的阳性信号，表明表达的病毒表位被阳性血清识别。而空载体对照转染的细胞中未发现阳性信号。 为了比较这5个位点的不同组合效果，一共构建了5个质粒载体，并在小鼠体内进行效力实验的比较。42只小鼠(雌性，4一6周龄)随机平均分成7组，每组6只。1组和2组是阴性对照组，只注射PBS和pVAXI空载体。组3到组7分别注射构建的5个质粒载体DNA:pVAX一SG，pVAX一N4，pVAX一Nsl，pVAX一Tsl和pVAX一51。所有的小鼠都注射2次，每次间隔3周，每次注射体积是100微升，量是200微克。血清中抗O型口蹄疫病毒的抗体用ELISA检测。脾脏淋巴细胞增殖用标准附T法测定。脾细胞分泌的工FN一Y和IL一4用ELISA试剂盒定量分析。脾细胞CTL活性用CTL检测试剂盒检测。CTL的靶细胞是用FuGENE6转染试剂将线形化的pcDNA一SG转染PS 15细胞，然后用G4 18(0.4 mg/ml一，)筛选得到的病毒表位的稳定表达克隆。这些阳性克隆的表达进一步用ELISA和RT一PCR得到确定。阳性克隆维持在含G418(0 .1 mg/ml一{2的培养基中。效应细胞是将分离的脾脏淋巴细胞在体外与全病毒蛋白(10林9 ml一，)共孵育7天而得到。结果表明只有pVAX一SG，pVAX一N4和pVAX一T51能诱导抗体产生，但是所有的重组质粒都能诱导细胞免疫应答，如淋巴细胞增殖和明显的CTL活性，以及诱导不同水平的IFN一Y和IL一4。通过比较发现编码位点5，1和T细胞表位的重组质粒能诱导全面的免疫应答，并且包含所有5个位点和T细胞表位的质粒pVAX一SG诱导了最强的免疫应答。 然而，pVAX一SG质粒DNA诱导产生的抗体水平(1:64，n二6)比灭活苗诱导的抗体水平(1:512，下6)显著低(p司.01)。体液免疫又一直被认为是抵抗病毒攻击最重要的。所以我们就采取了一系列策略以期提高抗体水平。首先，尝试加大DNA用量:其次，将人工L一2 cDNA与SG基因顺式表达，中间连接一个工RES片段;第三，用直径12微米的海藻酸钠微球包裹DNA。病毒特异性抗体用ELISA检测。结果表明三种策略可以不同程度地提高抗体水平。首先，通过增加注射的DNA量可以提高抗体水平，其中，注射总量为3毫克的最高剂量组(每隔2周注射一次，共注射3次)获得最高的抗体水平 (1:640)。顺式表达的人工L一2也帮助SG增加了1到2倍的抗体滴度。包裹入微粒的DNA则腹腔注射提高了2到6倍，肌肉注射提高1到2倍。口服和空载体对照都没有测到抗体。总之，?