研究背景:结直肠癌位列全球癌症发生率的第三位和肿瘤相关死亡率的第五位,是人类最常见的恶性肿瘤之一,也是癌症相关死亡的主要原因和重要原因。几十年来,外科技术、化疗、放疗相继用于结直肠癌的治疗,外科手术是主要的治疗方法,早期发现、早期诊断并早期治疗至关重要,而且单纯手术治疗尚不能治愈结直肠癌,即便配合化疗和放疗仍然具有较高的复发和转移的风险。近年来生物靶向治疗逐渐应用于结直肠癌的诊治并取得了一定的效果,目前的研究热点也集中于探寻和筛选出能够早期发现结直肠癌的肿瘤标记物。在诊断方面,电子结直肠镜检查仍然是目前筛查结直肠肿瘤的最重要手段,它是早期发现结直肠肿瘤的主要方法,而病理检查仍然是确诊结直肠癌的金标准,尽管如此,结肠镜和病理检查作为一项花费昂贵且依从性较低的侵入性检查,仍然具有较大的局限性。因此,寻找一种非侵入性的诊断标志物用以检测结直肠癌就显得非常必要。近年来,科学家们一直在探寻有关结直肠癌的诊断和预后判断方面的生物学标志物。最近研究发现,长链非编码RNA在结直肠癌的发生发展中扮演着重要的角色。microRNA(miRNA)的异常表达作为肿瘤抑制基因或癌基因在结直肠癌的发展和侵袭方面具有重要的功能作用。此外,miRNA可以靶向作用于数百个信使RNA(mRNA)进而干扰细胞信号转导通路。尤其是循环miRNAs被广泛认为是检测早期结直肠癌的非侵入性的生物学标志物,有助于了解结直肠癌的病因和生物学性质进而为提高结直肠癌的有效诊断并且丰富结直肠癌的治疗手段提供了可能性。近年来越来越多的研究表明,microRNA(miRNA)异常可以作为一种能够诊断恶性肿瘤的潜在的生物学标志物。高通量的转录技术是从肿瘤转录组的差异性或变化着手进行研究,对于阐明结直肠癌发生的分子机制,筛选出能够早期预测和干预肿瘤的分子标记物具有重要意义。此外,在肿瘤的形成和进展过程中,DNA甲基化的改变也可以通过影响肿瘤基因的表达而也发挥作用。由于癌症基因组图集(TCGA)数据门户包含临床信息、基因组表征数据、以及对结直肠腺癌(病例组)和正常结直肠粘膜(对照组)高水平的序列分析,因此可为揭示结直肠癌发病的分子机制提供前所未有的机遇。近年来越来越多的证据表明,miRNAs在结直肠癌的发生、发展和转移的病理学研究中是一种重要的调控因子,某些miRNA被认为是调控结直肠癌发生和发展过程中的癌基因或抑癌基因。我们前期的初步研究结果显示,miR-335在包括结直肠癌在内的恶性肿瘤的发生和发展过程中发挥了重要的作用,但其在分子水平上的具体作用机制尚不明确。本论文对大肠癌相关的miRNAs进行了初步的研究,通过识别结直肠癌的差异基因的表达,分析并构建了结直肠癌相关转录因子的调控网络。论文包括两个部分:第一部分对结直肠癌中microRNA/mRNA的表达特征进行了综合分析,探讨miR-335在结直肠癌中的功能作用。第二部分则着重对结直肠癌中的miR-335进行了详细的研究,通过对Twist1参与mir-335所介导的肿瘤细胞迁移、浸润、侵袭和上皮-间质转化(EMT)的研究,探讨并揭示了 miR-335抑制结直肠癌发生、发展、侵袭和转移过程中可能的分子机制。第一部分:结直肠癌中microRNA/mRNA表达特征的综合分析目的:(1)明确miRNA/mRNA在结肠腺癌(COAD)中的特征。(2)探讨miR-335在结直肠癌中的功能作用。方法:(1)截止2016年1月5日,从癌症基因组的基因图谱集(TCGA)中搜集出了包括459例患者的临床资料用以结直肠腺癌的基因图谱数据的分析。(2)通过R-bioconductor软件包deseq2计算miRNA和mRNA在结直肠癌和邻近癌旁正常组织中的差异表达情况,采用Benjamini和Hochberg方法进行多重比较获得错误发现率(FDR),通过miRNAs与mRNA的火山聚类图确定log2倍数变化绝对值,用以寻找差异表达的miRNA和mRNA。(3)利用生物信息学算法预测差异表达miRNA,经多种算法筛选出miRNA-mRNA靶基因对,利用Cytoscape 可视化软件(http://www.cytoscape.org/)最终构建出 miRNA的靶基因调控网络,利用Gene Codis在线软件进行功能注释和功能基因通路的富集,最终探寻针对结直肠癌中的miRNA的潜在作用靶点。(4)应用 COHCAP 在线软件(https://sourceforge.net/projects/cohcap/)确定结直肠腺癌与邻近的癌旁正常组织两者之间差异表达的甲基化基因。应用methyljhuUSC的methylation450平台进行DNA甲基化研究,应用COHCAP在线软件包确定与DNA甲基化水平呈负相关的差异表达基因。(5)从五例肿瘤根治标本中获得结直肠癌组织和癌旁正常的结直肠组织,分别对其进行定量PCR和RT-PCR实验,用2-△△CT方法分析相关基因的表达,使用人源18SrRNA和U6作为分析mRNA和miRNA表达的内对照(内参)。从基因表达库(GEO)中获取一个结直肠癌miRNA表达数据集(GSE83924)用以验证miRNAs的表达,对差异表达的miRNA作为结直肠癌生物学标志物的诊断效能进行评价。通过R-bioconductor软件包处理结直肠癌患者和健康对照组之间miRNA的差异表达获得受试者工作特征曲线(ROC)。结果:(1)通过对比研究,我们发现了 55个差异表达的miRNA和1291个差异表达的mRNA,结直肠腺癌中的miRNA呈总体上调趋势,通过软件算法不仅预测出58个miRNA-mRNA基因对,而且也发现 了其负相关性,其中 has-mir-141,has-mir-19a,has-mir-20a 和has-mir-335表达的增加与结直肠癌的癌变过程密切相关。(2)功能富集分析表明,miRNA靶基因在胰液、唾液、胃液和胆汁等分泌物中的表达显著增强。本研究发现了包括58个微小RNA基因的强健的识别标志,共鉴定出11个与DNA甲基化水平呈负相关的基因。其中,结直肠癌组织中的MSX1和KRT7基因明显下调和并且呈现出明显的DNA甲基化。(3)本研究结果显示,结直肠癌中miR-141表达上调、RSP02下调,可以调节大部分的目标,表明miR-141是早期诊断结直肠腺癌潜在的生物学标标志物。(4)miR-20a在结直肠癌中的表达显著上调,miR-20a的ROC曲线提示它对结直肠癌诊断中具有良好的诊断效能,可以作为一种具有潜在价值的生物学标记物。(5)mir-590在结直肠癌中的表达呈上调状态,mir-590很有可能是结直肠癌癌变过程的关键调节因子。(6)结直肠癌中miR-335的表达水平呈上调状态,可能在结直肠癌的发生、发展过程中扮演着重要的角色。结论:(1)本研究确定了八个在结直肠癌与正常结直肠组织中表达差异的miRNA,均为上调型miRNAs,可以作为结直肠癌早期诊断的生物学标志物。(2)本次研究对结直肠癌组织中11个相比于毗邻的癌旁正常结直肠组织表达下调且高甲基化的基因进行了初步鉴定,高甲基化可抑制这11个基因的表达,其中MSX1和KRT7的甲基化检测用于结直肠癌诊断的意义较大。(3)结直肠癌中miR-141表达上调、RSP02下调,可以调节大部分的目标,表明miR-141是早期诊断结直肠腺癌潜在的的生物学标志物。(4)miR-20a在结直肠癌中的表达显著上调,miR-20a的ROC曲线提示它在结直肠癌诊断中的价值,可以作为一种具有潜在价值的生物学标记物。(5)mir-590在结直肠癌中的表达呈显著上调状态,是结直肠癌发生、发展过程中的关键调节因子之一。(6)结直肠癌中miR-335的表达水平呈上调状态,在结直肠癌的发生、发展过程中扮演着重要的角色。第二部分:microRNA-335靶向Twist1抑制大肠癌HCT116细胞生长和上皮间质转化的研究目的:(1)探讨miR-335在结直肠癌的发生和发展过程中所发挥的具体作用。(2)通过对Twist1参与mir-335介导的肿瘤细胞迁移、浸润、侵袭和细胞上皮-间质转化(EMT)的研究,探讨并揭示miR-335抑制结直肠癌发生、发展、侵袭和转移过程中可能的分子机制。方法:(1)利用人结直肠癌HCT116细胞,通过转染miR-335的类似物和抑制剂使得miR-335在结直肠癌细胞中的表达发生改变。(2)分别应用CCK-8法、流式细胞仪、Transwell小室法和Western blot法分别检测肿瘤细胞的存活率、细胞凋亡、细胞迁移、浸润和EMT相关蛋白的表达,进一步评价了 miR-335在结直肠癌细胞中的功能作用。(3)通过应用双荧光素酶活性试验检测Twist1蛋白的表达。(4)通过细胞共转染miR-335抑制剂和siRNA沉默Twist1蛋白,重新评估肿瘤细胞的生长和转移情况。结果:(1)本研究结果显示,结直肠癌中miR-335的表达水平呈上调状态,可能在结直肠癌的发生、发展过程中扮演着重要的角色。(2)本研究结果显示,miR-335的过度表达抑制了细胞存活、迁移和侵袭,并促进了细胞凋亡率。miR-335的过度表达可以上调E-钙黏着蛋白,而下调N-钙黏着蛋白、波形蛋白和蜗牛蛋白。(3)本研究结果显示,Twist1是miR-335的直接靶向目标,沉默Twist1可以促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的活力,减少EMT相关蛋白的异常表达;而抑制miR-335可以抑制肿瘤细胞凋亡,增加细胞活力,增加EMT相关蛋白的异常表达。(4)本研究结果显示,沉默Twist1可以终止激活p65和IκBα所诱发的miR-335抑制,并且终止Wnt3a,Wnt5a和β-Catenin上调所诱发的miR-335抑制。结论:(1)miR-335可以抑制HCT116细胞生长、迁移、侵袭和EMT的过程,在结直肠癌的发生和发展过程中发挥着抑制肿瘤的作用。(2)Twist1是miR-335的直接靶向目标,miR-335可以通过抑制Twist1而发挥抑制结直肠癌细胞侵袭和转移的作用。(3)NF-κB信号通路和Wnt/β-catenin信号通路可能参与了 miR-335靶向Twist1调控结直肠癌生长、迁移和侵袭的全过程。(4)沉默Twist1可以终止激活p65和IκBα所诱发的miR-335抑制,并且终止Wnt3a,Wnt5a和β-Catenin上调所诱发的miR-335抑制。总之,microRNA在结直肠腺癌的早期诊断中具有潜在价值,特定miRNA的特征可能是消化道癌症的一个新兴的肿瘤标志物。通过对结直肠癌组织标本中miR-335和Twist1表达程度的分析,结合本研究所提供的证据,我们认为,miR-335在结直肠癌的发生合发展过程中发挥了抑制肿瘤的作用,miR-335可以抑制人结肠癌HCT116细胞的生长、迁移、侵袭和ETM的过程。Twist1是miR-335的直接靶向目标,miR-335可能通过抑制Twist 1而发挥抑制结直肠癌细胞侵袭和转移的作用。而NF-κB信号通路和Wnt/β-catenin信号通路都有可能参与了 miR-335靶向Twist1调控结直肠癌发生和进展的全过程。miR-335可以作为治疗转移性结直肠癌的新靶点,应用miR-335的反义核苷酸技术能够有效地抑制结直肠癌的生长、浸润和侵袭,具有一定的应用前景,有可能成为结直肠癌的一种新的辅助治疗手段,对其作用机制的深入研究有助于进一步认识结直肠癌浸润、侵袭和转移的本质。