世界卫生组织(WHO)在其发布的《HPV VLP疫苗质量、安全性及效力评价指导原则》中指出中和试验是评价HPV疫苗诱导的抗体是否具有保护作用的"金标准"。但传统的HPV中和抗体检测方法操作繁琐、检测周期长、重复性差,难于实现高通量检测,为了克服上述缺陷,我室建立了一种的基于化学发光报告基因Gluc的高通量假病毒中和抗体检测方法,并对该方法进行了系统的优化和验证。通过对影响检测的关键因素进行逐一优化,最终确定了方法的最优条件:检测细胞的最优加入量为30000细胞/孔96孔板),最优的病毒加入量使病毒对照和细胞对照的化学发光值差别在100倍左右,该情况下的病毒加入量为200TCID50左右,病毒加入后的最适孵育时间为72小时。同时比较了该方法与传统的基于绿色荧光蛋白(GFP)和分泌性碱性磷酸酶(SEAP)的检测方法的差异,该方法灵敏度高于GFP方法,与SEAP方法灵敏度相似。为了确定方法的cutoff值,用该方法检测了大量不同来源的可能会用于该检测的各种阴性样本,发现不同来源样本的非特异性反应不同,家兔血清>人血清>小鼠血清,如果将血清中的抗体纯化出来在用于上述检测,将会极大降低该非特异性反应,说明非特异性反应不是由抗体本身造成的,当样本的稀释度达到40倍事,样本的非异性反应基本消失,最终将检测样本的最低稀释度定为l:40,cutoff值为样本1:40倍稀释后,中和抑制率不低于50%的样本为阳性。该方法与两种传统方法相比,操作更为简便,将一块96孔板的检测时间由90分钟降低到2分钟,成本也只有传统方法的十分之一,由于操纵过程简便也极大的提高了方法的重现性,基于上述优点,该方法更适于大规模的血清学流行病学调查和临床试验。目前国内HPV疫苗生产企业和研发单位使用的疫苗效力检测方法主要是基于EGFP的假病毒中和抗体检测方法,该方法虽然重现性很好,但该方法结果读取方法还存在缺陷,目前主要有荧光显微镜观察和流氏细胞仪检测两种方式,前者缺乏客观性,不同检测者读取结果差异较大;后者操作读数准确,客观性强,但操作复杂,一块96孔板检测时间在两小时以上,特别不适于大规模的临床检定工作。将EGFP假病毒中和试验与ELIspot荧光检测方法Fluorospot结合起来,极大的提高了读取结果的客观性和读取效率,用该方法检测一块96孔板的时间在2分钟左右。对四价疫苗Gardasil免疫之后的10只小鼠血清分别用HPVl6和HPVl8假病毒检测其血清抗体滴度,并分别用CTL Fluorospot和流式细胞仪分别读取检测结果,对每份血清的每个稀释度分别读取一个数值,将两种方法的读取的数值做线性回归分析,两种假病毒中和试验中,两种结果读取方法都有很好的线性相关关系(R2=0.96)。接下来对影响检测的各种因素进行了优化,随着假病毒加入量的减少,病毒对照(只加细胞和假病毒,不加血清样本的检测孔)检测值逐渐降低。对同一份血清样本,当病毒量逐渐降低时,其IC50的检测值逐渐升高,即检测灵敏度随病毒量的增加而降低。但是当假病毒加入量使阳性细胞百分比降低至约5%时,中和曲线的线性相关系数R2会显著减低,为0.9左右,如果病毒加入量增加至高于15%时,R2均高于0.99,因此建议加入病毒产生的阳性细胞百分比不低于15%,对应的CTI fluorospot检测斑点数不低于100(仪器灵敏度设置值为210)。CTL fluorospot灵敏度设置值会影响细胞孔中荧光斑点的绝对计数,随着灵敏度设置值的降低,细胞孔中荧光斑点的绝对计数会降低,但如果设置值太高,会增高读数的非特异性,比较发现当灵敏度设置值为210时,所有的阴性孔读数均为0,随灵敏度设置值的降低,阳性孔的读数随之降低。根据每个灵敏度下的读数计算血清抗体IC50,发现当病毒加入量在建议范围内(病毒对照斑点数>100)时,灵敏度设置值在17～209之间变化时对IC50影响较小,建议将灵敏度设置值选择设定在180--200之间。该检测方法克服了之前结果判读客观性差和操作繁琐等缺限,其操作简便和高通量检测的特点使该方法更适于大规模的临床试验和血清学流行病学研究工作。