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目的:研究高苯丙氨酸对胚鼠皮层神经元胞浆游离钙的影响及其机制。
方法:共聚焦显微镜动态观测苯丙氨酸诱导不同时间点的胚鼠皮层神经元胞浆游离钙,并运用不同的钙离子通道抑制剂(标准无钙,钠细胞外液、细胞膜钙泵PMCA特异性抑制剂SiRNA及非特异性抑制剂Vanadate、内质网转运体SERCA抑制剂Thapsigargin、钠钙交换体NCX抑制剂KBR7943)阻断相应的钙通道后动态观察胞浆游离钙的变化;ATP酶水解法测定苯丙氨酸诱导不同时间点的PMCA酶活性;液闪仪检测苯丙氨酸诱导不同时间点的PMCA酶转运钙的能力。
结果:在体外培养的胚鼠大脑皮层神经元模型中,加入高浓度的苯丙氨酸(0.9raM)及其衍生物苯乳酸(0.5mM)均不同程度的降低胞浆游离钙,而加入苯乙酸(1.1mM)后胞浆游离钙先升高,3分钟以后开始下降。用EGTA+无钙液代替标准细胞外液,同不加苯丙氨酸的样本相比,加入苯丙氨酸的样本胞浆游离钙明显降低,说明苯丙氨酸可以增加钙离子外流;这种外流可以被细胞膜钙泵(PMCA)非特异的抑制剂vanadate阻断,而不能被钠钙交换体(NCX)特异性抑制剂KBR7943和内质网(肌浆网)钙转运体(SERCA)特异性抑制剂thapsigargin阻断,提示苯丙氨酸可能通过PMCA降低胞浆游离钙。液闪仪测定苯丙氨酸诱导的细胞膜钙转运能力增强和PMCA酶活性增高证实了这个结论。Vanadate在抑制PMCA的同时也可以抑制SERCA,所以我们用特异的siRNA抑制PMCA结果和vanadate相似。在本研究中,我们还用苯丙氨酸诱导神经元2周,在第3d、7d、9d、14d共聚焦显微镜观察胞浆游离钙的水平,结果发现胞浆游离钙水平在第9d开始升高,有意义的是PMCA酶活性和PMCA钙摄取能力在第9d的时候开始下降。
结论:本研究发现高浓度苯丙氨酸短期诱导降低胞浆游离钙,而诱导9天以后升高胞浆游离钙,与之相对应的是PMCA酶活性和转运功能先升高再降低。我们推测这可能是苯丙氨酸诱导早期PMCA适应性活性升高继之功能受损失代偿导致胞浆钙稳态失衡。PMCA肯定参与了高苯丙氨酸诱导的脑损伤机制,PMCA酶活性功能和胞浆钙离子稳态可能是苯丙氨酸所致的脑损伤的又一发病机制。