论文部分内容阅读
目的:通过研究miR-373在神经母细胞瘤(NB)组织和NB细胞系中的表达变化以及探讨其在NB细胞增殖,迁移和侵袭中的主要作用和具体的分子作用机制,为寻找新的NB治疗靶点提供方向和实验基础。方法:1.从2013年至2016年间在深圳市儿童医院收集20例高危NB和20例低危NB。采用q RT-PCR检测miR-373在高危NB组织和低危NB组织的表达情况。2.选取NB细胞系SK-N-BE(2)和SH-SY5Y进行细胞功能实验。将antimiR-373慢病毒感染SK-N-BE(2)和SH-SY5Y细胞构建miR-373低表达稳转株。采用MTT法、流式细胞仪和流式Annexin V染色法、Transwell迁移和侵袭法检测miR-373对NB细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。3.将miR-373低表达SK-N-BE(2)稳转株皮下注射到NOG小鼠右肢,观察miR-373低表达对NB细胞皮下成瘤能力的影响。采用免疫组化检测各组Ki67表达情况,验证miR-373低表达对NB增长的影响。4.运用miRanda、Target Scan和Pic Tar生物信息学预测软件对miR-373进行靶基因预测,筛选出SRCIN1为miR-373的一个潜在下游靶基因。运用双荧光素酶报告基因验证miR-373与SRCIN1相结合的活性。运用q RT-PCR和western blotting检测miR-373低表达和过表达NB细胞中SRCIN1 mRNA和蛋白表达水平。运用q RT-PCR检测20例高危NB组织和20例低危NB组织中SRCIN1 mRNA表达水平。5.通过si RNA沉默miR-373,低表达SK-N-BE(2)和SH-SY5Y稳转株中SRCIN1基因,采用MTT法、流式细胞仪和流式Annexin V染色法、Transwell迁移和侵袭法检测SRCIN1的沉默对NB细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结果:1.与低危NB相比,miR-373在高危NB中的表达水平明显上调。2.AntimiR-373慢病毒感染NB细胞后,细胞中的miR-373表达量明显下调,细胞活性、细胞周期、迁移和侵袭能力均受到明显抑制,并诱导细胞凋亡。3.Mi R-373低表达能够降低NB细胞的NOG小鼠成瘤能力,缩小移植瘤体积,减轻瘤重,下调组织的中miR-373和Ki67的表达量。4.Mi R-373能够直接结合SRCIN1 3′UTR,对其起负向调控作用。miR-373过表达能够降低SRCIN1 mRNA和蛋白表达水平,miR-373低表达能够增加SRCIN1 mRNA和蛋白表达水平。SRCIN1在高危NB组织中的表达量明显低于低危NB组织的表达量。miR-373与SRCIN1在NB组织中的表达量呈负向相关性。5.通过si RNA沉默miR-373,低表达SK-N-BE(2)和SH-SY5Y稳转株中SRCIN1基因,能够增加细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力,以及降低细胞凋亡率,从而使miR-373低表达对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用被抵消。结论:1.miR-373在NB组织和细胞系中呈现高水平表达。2.miR-373低表达能够抑制体内外细胞增殖,降低细胞迁移和侵袭能力,以及促进细胞凋亡。3.miR-373通过负性调控其靶基因SRCIN1的表达,从而促进NB细胞活性、细胞周期、迁移和侵袭,和抑制细胞凋亡。