目的:甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤。近年来其发病率迅猛上升,约占女性恶性肿瘤的5-10%。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid cancer,PTC）是甲状腺癌最常见的病理亚型,占所有甲状腺癌的90%。大多数PTC在接受手术及术后放射性碘治疗后预后良好,5年的生存率超过95%。但仍有一些PTC预后不良,表现为肿瘤复发、广泛的侵袭转移,10年的生存率低于40%。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸,不具有编码蛋白质能力的RNA。文献报道lncRNA参与多种疾病的发生与发展。LncRNA NEAT1最早发现于注射了日本脑炎病毒和狂犬病病毒的鼠脑中,是核旁斑的重要组成,对于旁斑的形成、维持旁斑结构发挥重要作用,NEAT1有两个转录本NEAT1₁和NEAT1₂。最新的文献报道NEAT1能在多种肿瘤如肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌和结肠癌中发挥促进肿瘤发生发展的作用。我们之前的研究结果显示,在配对的5对PTC组织及癌旁组织lncRNA表达芯片中,NEAT1₂在癌组织中的表达显著高于癌旁组织达4.65倍。然而,在PTC中NEAT1₂的表达、具体功能并不清楚。ATAD2基因,位于人类染色体8q24.13。其编码的蛋白含有2个AAA（ATPase associated with diverse celluar activities）区域和一个溴区结构域（Bromodomain）。AAA区域通常作为分子伴侣,在细胞内发挥装配、分解蛋白复合物的功能;溴区结构域则参与基因的转录调控、细胞周期的调控和信号转导。文献报道ATAD2在肝癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌中显著高表达,其高表达与较高肿瘤分期、不良组织分型、淋巴结转移和不良的预后呈正相关。然而,PTC中ATAD2的表达及功能未见报道。本文旨在研究NEAT1₂在PTC组织及癌旁组织中的表达及其在PTC细胞系中所发挥的功能。论证NEAT1₂可以通过调控ATAD2蛋白发挥其在PTC中的促癌作用,并进一步解释NEAT1₂调控ATAD2的具体机制。方法:1、收集2014年10月-2015年8月中国医科大学附属第一医院甲状腺外科手术切除的87对PTC组织及配对的癌旁组织并且统计相关的临床病理资料。2、利用qRT-PCR检测87对PTC组织及癌旁组织中NEAT1₂的表达并利用卡方检验分析PTC组织中NEAT1₂的表达与临床病理资料的关系。转染si-NEAT1₂下调NEAT1₂表达,使用qRT-PCR检测干扰效率。利用CCK8检测NEAT1₂对PTC细胞生长的影响、利用Transwell检测NEAT1₂对PTC细胞迁移和侵袭的影响、利用划痕实验检测NEAT1₂对PTC细胞迁移的影响、利用流式细胞仪检测NEAT1₂对PTC细胞凋亡的影响、利用western blot检测NEAT1₂对凋亡和侵袭相关蛋白的影响。3、利用qRT-PCR和western blot检测下调NEAT1₂后ATAD2的表达。4、利用qRT-PCR检测87对PTC组织及癌旁组织中ATAD2的表达并使用卡方检验分析PTC组织中ATAD2的表达与临床病理资料的关系。转染si-ATAD2下调ATAD2表达,使用qRT-PCR检测干扰效率。利用CCK8检测ATAD2对PTC细胞生长的影响、利用Transwell检测ATAD2对PTC细胞迁移和侵袭的影响、利用划痕实验检测ATAD2对PTC细胞迁移的影响、利用流式细胞仪检测ATAD2对PTC细胞凋亡的影响。5、使用ATAD2过表达质粒建立ATAD2过表达PTC细胞系,利用western blot、CCK8、Transwell、划痕实验和流式细胞仪分别检测NC、si-NEAT1₂和si-NEAT1₂+ATAD2的ATAD2蛋白表达、细胞生长、迁移与侵袭能力、凋亡水平的变化。6、利用“种子区配比”及Targetscan预测同时能与NEAT1₂和ATAD2 3’UTR共同结合的mi RNAs。利用qRT-PCR检测NC组及si-NEAT1₂组的miRNAs表达,筛选可能与NEAT1₂结合的miRNAs。使用miR-106a-5p mimic、miR-106b-5p mimic和mi R-17-5p mimic转染PTC细胞过表达miR-106a-5p、miR-106b-5p和miR-17-5p并使用western blot检测ATAD2蛋白水平的变化。7、利用qRT-PCR检测87对PTC组织及癌旁组织中miR-106b-5p的表达水平。利用Pearson相关检验87例PTC组织中NEAT1₂和miR-106b-5p表达的相关性。8、利用萤光素酶报告基因证明miR-106b-5p是否能与NEAT1₂和ATAD2的3’URT直接结合,NEAT1₂是否能通过竞争性结合miR-106b-5p调控ATAD2的表达。结果:1、NEAT1₂在PTC组织中的表达显著高于配对的癌旁组织,其在PTC中的表达与肿瘤的直径相关。2、在PTC细胞中敲除NEAT1₂能抑制细胞的生长、诱导细胞凋亡,下调凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达。在PTC细胞中敲除NEAT1₂能抑制细胞的迁移和侵袭能力并且改变与迁移和侵袭相关的EMT相关蛋白和MMP蛋白的表达。3、在PTC细胞中敲除NEAT1₂能显著地下调ATAD2mRNA和蛋白质的表达。4、ATAD2在PTC组织中表达显著高于配对癌旁组织,在PTC组织中的表达与肿瘤的直径相关。在PTC细胞中敲除ATAD2能显著抑制细胞的生长、诱导细胞凋亡,抑制细胞的迁移和侵袭能力。5、过表达ATAD2能部分恢复si-NEAT1₂对PTC细胞生长抑制、诱导凋亡、迁移和侵袭的抑制作用。6、通过利用“种子区配比”及targetscan预测共28个miRNAs可能与NEAT1₂和ATAD2直接结合。通过qRT-PCR进一步验证发现miR-106a-5p、miR-106b-5p和miR-17-5p可能与NEAT1₂直接结合。在PTC细胞中过表达miR-106a-5p、miR-106b-5p和miR-17-5p,发现只有过表达miR-106b-5p后下游的ATAD2蛋白表达显著下降,过表达miR-106a-5p和miR-17-5p后下游的ATAD2蛋白表达无明显变化。7、在87对PTC组织及癌旁配对组织中,miR-106b-5p在PTC组织中显著低表达。在PTC组织中miR-106b-5p表达与NEAT1₂的表达呈负相关。8、萤光素酶报告基因表明,miR-106b-5p能与NEAT1₂和ATAD2 3’UTR直接结合,并且NEAT1₂能通过竞争性结合miR-106b-5p调控ATAD2的表达。结论:长链非编码RNA NEAT1₂通过竞争性结miR-106b-5p调控ATAD2的表达在甲状腺乳头状癌中发挥促侵袭和抗凋亡的作用