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目的：在于明确E1在AngⅡ诱导DC活化过程中的作用和分子机制.通过给予小鼠骨髓来源树突状细胞PYR41和AngⅡ刺激,采用流式细胞仪检测成熟树突状细胞表面标志物CD40、CD80、CD86、MHCⅡ的表达;Elisa试剂盒检测细胞培养上清中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12的分泌;混合淋巴细胞反应的方法检测树突状细胞刺激小鼠脾脏来源单个核淋巴细胞增殖能力三个方面明确PYR41对Ang Ⅱ诱导的树突状细胞活化作用的影响.通过采用western blot和免疫沉淀方法在树突状细胞系DC2.4和原代树突状细胞上探讨E1参与Ang Ⅱ诱导DC活化的相关信号途径,为寻找有效的临床干预提供理论和试验依据.
方法：1.小鼠骨髓来源树突状细胞的分离诱导培养:采用GM-CSF诱导小鼠骨髓冲洗液中的细胞向树突状细胞分化,第11天时,采用LPS (1ug/ml)、AngⅡ(100nM)诱导树突状细胞成熟.2.细胞活性测定:采用MTT法检测PYR41对树突状细胞存活能力的影响并确定后续试验中PYR41的工作浓度.3.细胞处理方式:给予树突状细胞系DC2.4和小鼠骨髓来源原代树突状细胞不同浓度PYR41预处理30min后与Ang Ⅱ孵育不同时间,检测不同指标;单独加DMSO组作为空白对照,LPS处理组作为阳性对照.4.树突状细胞表型检测:采用流式细胞仪检测树突状细胞表面标志物CD11c、CD40、CD80、CD86、MHCⅡ的表达.5.树突状细胞刺激淋巴细胞增殖能力:采用混合淋巴细胞反应检测不同处理组中DC刺激淋巴细胞增值能力.6.树突状细胞细胞因子分泌:采用ELISA试剂盒检测树突状细胞分泌促炎因子TNF-α、IL-6、IL-12的水平.7.Western Blot蛋白免疫印迹法检测:细胞中E1蛋白的表达与定量,NF-κB、MAPKs和STAT1信号通路的活化与定量.8.免疫共沉淀Co-IP检测:TRAF6和NEMO/IKKγ上K63泛素链修饰.9.统计学分析:所有数据都以平均值±标准差表示.组间差异统计分析采用t检验;P＜0.05认为差异具有统计学意义.
结果：1.采用GM-CSF诱导培养小鼠骨髓细胞分化为树突状细胞至第11天时,树突状细胞表面标志物CD11c大于80％.2.AngⅡ刺激树突状细胞2h以后,E1在蛋白和RNA水平上表达增高.3.E1抑制剂PYR41处理导致AngⅡ诱导小鼠骨髓来源树突状细胞的表型成熟能力减弱.4.E1抑制剂PYR41处理降低了AngⅡ诱导的小鼠骨髓来源树突状细胞分泌促炎细胞因子的水平.5.E1抑制剂PYR41处理削弱了AngⅡ诱导小鼠骨髓来源树突状细胞刺激同种异体淋巴细胞增殖和活化的能力.6.AngⅡ刺激引起树突状细胞内NF-κB、STAT1信号通路和MAPKs信号通路中ERK1/2的活化.7.E1抑制剂PYR41处理抑制了TRAF6和NEMO/IKKγ上K63泛素链修饰、Iκ Ba的降解和NF-κ B信号通路的激活.8.E1抑制剂PYR41处理抑制MKP-1的降解和ERK1/2/STAT1通路的激活.
结论：1.E1对AngⅡ诱导的树突状细胞的表型成熟和功能活化具有重要的调节作用.2.NF- B、STAT1信号通路和MAPKs信号通路中ERK1/2的活化参与AngⅡ诱导的树突状细胞成熟和活化过程中.3.E1通过促进MKP-1的降解激活ERK1/2/STAT1通路参与AngⅡ诱导树突状细胞成熟和活化过程中.4.E1通过TRAF6和NEMO/IKKγ上K63泛素链修饰促进IKK的活化和IκBa的降解激活NF-κB信号通路是AngⅡ引起的树突状细胞成熟和活化的可能机制之一.