【摘 要】
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本文根据虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)18S的保守序列设计4套环介导等温扩增(LAMP)引物,从中筛选出一套引物对LAMP反应体系(Bst DNA聚合酶浓度、内外引物浓度
【机 构】
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东莞出入境检验检疫局; 暨南大学食品安全与营养研究院;
【基金项目】
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2017年广东检验检疫局项目(2017GDK04)
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本文根据虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)18S的保守序列设计4套环介导等温扩增(LAMP)引物,从中筛选出一套引物对LAMP反应体系(Bst DNA聚合酶浓度、内外引物浓度比、d NTP浓度、Mg2+浓度)和反应条件(温度)进行优化。并对优化后的LAMP反应体系和条件进行特异性、灵敏度及精密度验证。特异性试验表明,该方法能特异性检测虾肝肠胞虫,而与其他病害的核酸没有交叉反应;灵敏度试验表明,可检测浓度为10 fg/μL的质粒DNA,制作的标准曲线可对虾肝肠胞虫进行定量分析。重复性试验结果表明,该方法 Ct值的变异系数为2.88%-3.02%,具有良好的稳定性。而对于人工侵染的虾肝肠胞虫样品,LAMP方法可检测低至0.44 pg/μL。应用建立的LAMP方法对3个不同地区的120份凡纳滨对虾样品进行检测,检测结果表明EHP阳性样品数为43,与q PCR检测结果符合率达96%。本研究所建立的LAMP方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,并能在30min内完成样品的检测,是快速、定量检测虾肝肠胞虫的有效手段。
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