来源于极端嗜热环境嗜热菌的酶类具有极好的高温反应活性和稳定性,在能源、化工、食品和医药等行业展现出越来越广阔的应用潜力。了解嗜热环境中嗜热微生物的分布情况,可为在嗜热环境中筛选嗜热菌,分离纯化嗜热酶提供基础。嗜热酶因为有良好的应用前景而备受关注,对于嗜热酶稳定性相关的结构特征的研究,将揭示酶高温反应机制的分子基础,为将来发现嗜热酶的新功能,指导酶分子设计和改造提供必要的理论依据。本论文研究主要包括以下几个部分:1.云南腾冲热泉的嗜热微生物遗传多样性分析由于传统的菌株分离方法不够全面,分离到的可培养的菌株只能代表自然环境中嗜热菌群的一小部分。随着未可培养方法的完善和发展,已经有能力对环境中那些行驶重要功能但是目前没有办法分离的嗜热微生物进行群落分析和系统发育关系等方面的研究。在本研究中,我们从云南腾冲热泉中选取了7个不同的取样地点的泥样样品,利用未可培养方法研究热泉群落中的多样性。以热泉泥样中提取的环境总DNA为模板,得到的16S rDNA基因序列,建立进化树分析。发现热泉环境中存在着大量的未培养的嗜热微生物,包括嗜热细菌和嗜热古菌。由于不同的热泉环境中成分的不同,我们在不同的热泉点得到不同的嗜热菌的信息。基于得到的16S rDNA序列分析,我们了解到环境中存在着大量的未可培养的嗜热微生物,这也说明了我们所使用的传统分离方法的局限性。进一步分析表明,无论是分离到的菌株,还是DNA水平得到的序列都不能真实地反映在嗜热环境中具有较高的代谢活性、行使生态功能的嗜热菌群的组成。但是我们的研究结果对了解腾冲热泉中没有鉴定的嗜热的细菌和嗜热古菌提供了重要依据,为将来的嗜热菌的分离和其中嗜热酶的研究提供基础。2.羽毛降解角蛋白酶菌株筛选及酶学性质鉴定角蛋白是一种不可溶的、结构稳定的蛋白质,羽毛的主要成分是角蛋白,不能被一般的蛋白酶降解。我国羽毛角蛋白资源丰富,畜禽类羽毛蕴含了大量潜在的蛋白质和氨基酸,若合理利用可作为优质饲料蛋白。但是因为其结构稳定,极难降解,所以找到合适的方法是研究降解角蛋白的关键。传统物理、化学降解法存在众多缺陷,诸如效率低、耗能高、污染大,而采用微生物降解法效果显著,既利用了蛋白资源,也有利于环境保护。因此角蛋白及角蛋白酶的研究有广阔的应用前景及较高的经济价值和社会价值。我们在腾冲热泉中筛选到一株好氧的嗜热芽孢杆菌,对其进行了生理生化鉴定和16S rDNA进行了分析,鉴定该菌株属于Geobacillus,命名为Geobacillus sp.RD-2,该菌株的最适生长温度是60℃,最适生长pH 7.5。利用不同的纯化方法,在胞外得到了角蛋白酶,分子量大小约为65 kDa。以天青角蛋白为底物,检测该酶的生化性质,结果表明该嗜热酶的酶活最适温度是75℃,最适pH 8.0。另外我们发现,当加入DTT后,角蛋白酶的活性增加两倍以上,这个结果表明还原剂能够协助酶打断底物的二硫键,使酶更容易作用底物。以上研究表明,得到的嗜热角蛋白酶可能在工业上有广泛的应用前景。3.嗜热脂肪酶酶学性质研究及残基Y224突变对酶热稳定性的影响近年来,来自嗜热菌的嗜热脂肪酶得到了广泛的关注,主要是由于其热稳定性使嗜热脂肪酶能够在工业生产中得到更为广泛的应用。我们在Geobacillus sp.RD-2的基因组中克隆到一个脂肪酶lipGRD基因,并在大肠杆菌中和毕赤酵母中表达了lipGRD蛋白。经热处理,Ni-NTA柱亲和层析纯化,得到了纯化的重组lipGRD蛋白。SDS-PAGE结果显示,lipGRD蛋白单体分子量为43.0 KDa。对其进行了生化性质鉴定,其酶活的最适温度是55℃,最适pH是7.5,并且有比较好的耐热性。在基因克隆中我们偶然得到了一个不耐热的突变体,研究发现lipGRD氨基酸序列的224位酪氨酸变为半胱氨酸后,酶丧失了耐热性,酶的最适温度是35℃。对该位点进行了一系列的饱和诱变分析,发现酪氨酸变为脯氨酸后,酶的热稳定性得到了提高,酶的最适温度是65℃。根据Geobacillus stearothermophilus L1脂肪酶的晶体结构,模拟出lipGRD的结构图,酶的活性位点被一个长的“盖子”α6螺旋所覆盖,高温的条件下,“盖子”打开,暴露出活性位点,因此,α6螺旋被称为温度开关,Tyr224位于α6螺旋下游的α7螺旋上,有报道说中温酶中没有发现α7-α9结构,可能是嗜热酶所特有的结构,能够控制酶的热稳定性。对于突变体lipGRD/Y224C,224位的半胱氨酸可能和64位的半胱氧酸形成二硫键,改变了蛋白的结构,推测影响了温度开关α6的状态,从而在低温下暴露出活性位点与底物反应,降低了酶的热稳定性。当224位突变为脯氨酸后,与相邻的几个脯氨酸有相互作用,推测可能提高了α6螺旋与α7螺旋之间的疏水作用力,提高了酶的热稳定性。我们的实验结果表明,通过点突变的变化可改变蛋白的结构及酶的热稳定性,以期适应工业上不同的要求。