【摘 要】
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目的:构建Pfs25基因的多拷贝分泌表达菌株,提高Pfs25蛋白的表达水平。方法:PCR扩增分泌信号肽α因子基因与Pfs25基因的融合基因(简称αPfs25),αPfs25融合基因与胞内表达载体
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目的:构建Pfs25基因的多拷贝分泌表达菌株,提高Pfs25蛋白的表达水平。方法:PCR扩增分泌信号肽α因子基因与Pfs25基因的融合基因(简称αPfs25),αPfs25融合基因与胞内表达载体pAO815连接,构建Pfs25单拷贝分泌表达质粒pAO815-αPfs25。限制性内切酶BglⅡ和BamHI双酶切单拷贝质粒获得基因表达盒AOX1-αPfs25-AOX1(TT)。表达盒连接到BamHI线化的单拷贝表达质粒,依次重复,构建多拷贝重组质粒pAO815-[AOX1αPfs25-AOX1(TT)]n。线性化的多拷贝重组质粒电穿孔法转化毕赤酵母GS15宿主菌,转化物经MD平板和甲醇诱导表达实验筛选,获得高表达Pfs25重组酵母菌株。结果:构建了1,2,3,4,5,6,7,8,10,12和14拷贝的重组菌株,所构建的8拷贝表达菌株表达量最高。结论:已成功构建Pfs25多拷贝表达质粒及菌株,显著提高了Pfs25蛋白的表达水平。
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