【摘 要】
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目的：利用T载体完成大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因PCR产物的克隆.方法：250g左右SD大鼠,TRIzol试剂(美国invitrogen公司),DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿、异丙醇、无水乙醇均为国产分析纯,M-MLV逆转录酶,BDNF上、下游引物,ExTaq酶(日本TAKARA公司),DH5α菌种为本实验室保存,E.Z.N.A质粒抽提试剂盒I(美国Omega公司),pMD18-T载体等
【机 构】
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中山大学第二附属医院,骨科,广州,510120 中山大学第二附属医院,脐血库,广州,510120
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目的：利用T载体完成大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因PCR产物的克隆.
方法：250g左右SD大鼠,TRIzol试剂(美国invitrogen公司),DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿、异丙醇、无水乙醇均为国产分析纯,M-MLV逆转录酶,BDNF上、下游引物,ExTaq酶(日本TAKARA公司),DH5α菌种为本实验室保存,E.Z.N.A质粒抽提试剂盒I(美国Omega公司),pMD18-T载体等,QIAquick胶回收试剂盒(德国QIAGEN公司),X-gal和IPTG(美国Promega公司);首先提取大鼠脑组织总RNA,然后利用MMV逆转录酶及oligo-dT引物逆转录合成cDNA第一条链,再利用exTaq酶及BDNF上、下游引物扩增出BDNFcDNA,最后利用T4连接酶将BDNF基因克隆入T载体用于下一步测序及其他克隆.
结果：成功构建了BDNF基因T载体,经双脱氧链终止法测序证实为大鼠BDNF基因。
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