【摘 要】
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本研究以Zmpste24-缺陷早衰小鼠胚胎成纤维细胞(Zmpste24/-MEFs)为研究对象,利用Co-IP、免疫荧光、western blotting和与衰老相关的B-半乳糖苷酶染色等实验技术,重点探讨Zmpste24/-MEFs中HP1与异常prelaminA结合是否导致其分布异常,以及与Zmpste24-/-MEFs中DNA损伤修复障碍的联系.研究结果显示:1.三种HP1亚型中,HP1α与
【机 构】
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深圳大学医学院生物化学与分子医学系 香港大学李嘉诚医学院生物化学系
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本研究以Zmpste24-缺陷早衰小鼠胚胎成纤维细胞(Zmpste24/-MEFs)为研究对象,利用Co-IP、免疫荧光、western blotting和与衰老相关的B-半乳糖苷酶染色等实验技术,重点探讨Zmpste24/-MEFs中HP1与异常prelaminA结合是否导致其分布异常,以及与Zmpste24-/-MEFs中DNA损伤修复障碍的联系.研究结果显示:1.三种HP1亚型中,HP1α与异常Prelamin A有较强相互作用,并且和HP1α与lamin A的相互作用类似;2.HP1与异染色质标志物组蛋白H3K9Me3共定位分析显示,Zmpste24-/-MEFs中HP1α虽然信号强度增加,但与H3K9Me3共定位程度明显低于Zmpste24+/+ MEFs,而HP1β与HP1γ信号强度及其与H3K9Me3共定位程度在两种细胞中无明显差异;3.DNA损伤前,Zmpste24-/-MEFs中DNA损伤信号γH2AX数量较多,说明该细胞本身即存在DNA损伤;给于细胞4μM喜树碱(CPT)造成DNA损伤后,Zmpste24-/-MEFs中γH2AX信号数量变化显示DNA修复延迟,但HP1α本身信号数量和强度在两种细胞中未见明显变化;4.HP1α以Thr50位点磷酸化的形式脱离H3K9Me3并参与异染色质DNA损伤修复,HP1αT50P信号数量在Zmpste24+/+MEFs中DNA损伤后0-4小时内呈现先增多后减少的动态变化过程,与γH2AX相类似,两者共定位灶比例在DNA损伤后4小时可达到90％;而在Zmpste24-/-MEFs中,HP1αT50信号变化趋势不如对照细胞明显且延后,并伴随HP1αT50P与γH2AX共定位灶数目减少,DNA损伤后4小时只有约55％的共定位灶.5.siHP1α明显减少HP1α和HP1αT50P蛋白水平,但DNA损伤后HP1αT50P仍然明显升高.损伤后4小时HP1αT50P与γH2AX共定位灶比例提高到约77％.与衰老相关的β-半乳糖苷酶检测发现siHP1α处理的Zmpste24-/-MEFs中蓝染细胞比例由53％下降到25％,同时P16升高的基因表达也部分恢复.以上实验结果说明,异常LaminA不仅引起核膜结构异常,也影响了异染色质在核内的分布;三种亚型HP1中,HP1α蛋白水平升高且在Zmpste24-/-早老小鼠MEFs中分布异常;DNA损伤后,HP1αT50P磷酸化水平较低、信号产生和消失时间明显延后.降低早老小鼠HP1α水平后有利于松弛异染色质,提高HP1αT50P动员以及募集到DNA损伤位点的能力,促进DNA损伤修复,有利于缓解早老细胞衰老表型的出现.在由此看出,HP1α是引起早老细胞中DNA修复障碍和衰老表型出现的重要原因,也为正常衰老发生机制和抗衰老研究提供了新靶点.
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