单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)是革兰氏阳性菌无芽胞杆菌,同时也是是重要的人兽共患食源性病原菌,可突破宿主的消化道屏障、血脑屏障和胎盘屏障,引发胃肠炎、败血症、脑膜炎和流产等临床症状.从体外环境进入到消化道和宿主细胞内,单增李斯特菌将面临各种氧化应激.那么,李斯特菌如何在氧化应激条件下维持细胞内的二硫键稳态的呢?细菌的Trx系统对于修复由氧自由基ROS(Reactive oxygen species)或超氧离子等对蛋白核酸造成的氧化损伤,从而维持细胞内的氧化还原稳态具有重要的作用.那么,单增李斯特菌如何通过Trx系统维持细胞内的二硫键稳态的呢?首先,对TrxA和TrxB的蛋白功能进行了研究.通过大肠杆菌原核表达系统,我们成功表达并纯化了含有CxxC基序的TrxA和TrxB,且均为可溶性形式.以胰岛素为底物的二硫键还原酶活性分析发现TrxA的二硫键还原酶活性很高,比大肠杆菌和霍乱弧菌的DsbA蛋白的酶活性高出10到20倍.通过对TrxA的酶动力学分析发现,TrxA的催化作用表现出协同效应,这说明TrxA的蛋白构象在催化过程中发生改变,从而促进酶与底物的亲和力,增强酶的活性,这也许是李斯特菌TrxA还原酶活力比大肠杆菌和霍乱弧菌的DsbA蛋白酶活性高的原因.对TrxB的酶活性分析发现,TrxB基本无二硫键还原酶活性.Westem blot分析在不同生长条件下的蛋白表达水平发现,在14mM的脱氧胆酸钠的诱导下,TrxA的表达量明显的增强,而TrxB的表达量没有却变化.脱氧胆酸钠是动物肠道中的次级胆酸盐,能破坏细菌体内的氧化还原稳态,从而对细菌的生长具有抑制甚至致死的作用.所以当单增李斯特菌进入含有高浓度脱氧胆酸钠的肠道环境后,TrxA的大量表达必将有助于李斯特菌抵抗由脱氧胆酸钠引起的氧还稳态的紊乱.另外,在固体、半固体和液体培养基中生长实验表明,trxA缺失后菌落变小、生长滞后.过氧化氢应激实验发现,trxA 缺失株对H2O2敏感性显著增强,推测TrxA对于由H202引起的损伤蛋白的修复具有重要作用.上皮细胞Caco-的黏附实验并未发现trxA缺失株与野生型菌株的显著差异,然而通过巨噬细胞Raw264.7的侵袭实验发现在细胞侵染前期,AtrxA与野生型菌株表现出相似的增值效率,而在侵染后期,△trxA的增值效率明显低于野生型菌株,这说明在侵染后期,巨噬细胞产生大量的氧自由基,在这种条件下,TrxA对于菌体的抗氧化作用尤为重要.小鼠实验表明,txA缺失株的毒力下降,这进一步说明TrxA在体内对单增李斯特菌毒力基因的表达产生了影响.本研究为揭示硫氧还蛋白系统在革兰氏阳性胞内菌中的抗氧化机制奠定了基础.