核仁不仅是核糖体合成与加工的场所,也与细胞周期调控、DNA损伤修复、压力信号应答等生化过程有关。核仁作为细胞核内致密的非膜细胞器,富集了超过4,500种不同蛋白质。然而,人们对于这些蛋白质在核仁中的功能以及这些蛋白在核仁中是如何被调控的所知甚少。本实验室之前的研究发现核仁蛋白Def(Digestive-organexpansion factor)能够介导半胱氨酸蛋白酶 CAPN3(Calpain3)降解p53。但是我们并不清楚Def如何帮助CAPN3降解p53,也不知Def-CAPN3在核仁内是否还存在其他靶蛋白。本研究首先发现人CAPN3能够降解p53A138V、p53M2371、p53R248W和p53R273P,而不能降解p53R175H。p53R175H作为癌症样品中出现频率最高的p53点突变,提示了 CAPN3在肿瘤形成中的意义。通过免疫共沉淀实验,我们证明Def与人CAPN3能够直接互作,并在核仁内形成蛋白复合体。我们发现这种互作在斑马鱼上也具有保守性,斑马鱼Def能够与Capn3b(人CAPN3在斑马鱼上的同源蛋白)在核仁内形成蛋白复合体。进一步的研究发现,Def能够通过磷酸化修饰调控其与CAPN3的结合能力,招募CAPN3进入核仁降解p53。此外,Def-CAPN3对细胞周期及斑马鱼器官发育的调控也是部分通过p53实现的。在两个不同的Caapn3b基因敲除品系斑马鱼的肝脏细胞中,p53都大量积累于核仁。虽然该斑马鱼纯合突变体可正常繁育,但是成年鱼表现出体长变短、躯体易侧弯的症状,与capn3基因突变引起的先天性肢带型肌肉营养不良(LGMD2A)症状类似。为了寻找Def-CAPN3在核仁内的其他靶蛋白,我们通过蛋白质组学技术分析了capn3b基因敲除斑马鱼与野生型斑马鱼肝脏细胞核仁中差异表达的蛋白,发现了 119个在capn3b突变鱼中上调(超过1.45倍)的核蛋白,其中核仁蛋白33个。对其中8个候选蛋白进行体内、体外的验证实验,证明其中7个(LmnA、Nkap、Ddx18、Cdk9、Hmgb1、Tra2a、Bbofl)蛋白能够被CAPN3降解,而且能够被Def诱导降解。此外,通过对蛋白质组学数据的深入分析,我们发现Capn3b还参与了免疫系统的调节,这解释了为何部分LGMD2A患者在发病早期出现炎症反应。综上所述,我们的研究首次阐明了 Def-CAPN3降解途径能够在核仁内通过对靶蛋白的降解,调控细胞周期进程及器官发育。作为首个斑马鱼核仁蛋白质组学研究,我们的工作不仅为斑马鱼核仁蛋白功能的研究提供了帮助,也通过这种方法鉴定出了 7个Def-CAPN3的新底物,为Def-CAPN3的功能研究提供了新的基础。此外,我们所构建的capn3b基因敲除斑马鱼能够作为LGMD2A疾病研究模型,将来可用于药物筛选。