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目的 本研究旨在构建过表达Foxp3和A20微小核糖核酸(miRNA)修饰调节性T淋巴细胞(Treg)的DSL6A/C1细胞与树突状细胞的融合疫苗,获得既有树突状细胞(DC)特殊功能又表达肿瘤抗原的新型肿瘤疫苗.检测融合疫苗中Foxp3和A20基因及蛋白表达情况,体外分析融合疫苗的活性、CTL杀伤力以及抗体分泌能力,初步探讨疫苗抗胰腺肿瘤的免疫效应,为进一步将多基因修饰的肿瘤疫苗用于胰腺癌的防治研究奠定理论基础.方法 构建负载过表达Foxp3质粒和A20 miRNA质粒,采用慢病毒法共转染到DSL6A/C1细胞,抗菌药物筛选稳转细胞株,利用取聚乙二醇(PEG)与树突状细胞融合而构建融合疫苗,采用Western印迹、PCR检测Foxp3、A20的表达量.免疫磁珠分选纯化疫苗,流式细胞仪对融合细胞表型鉴定,MTT、Transwell检测多基因融合疫苗活性、迁移能力,LDH杀伤实验检测CD8+T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,采用酶联免疫斑点(ELISpot)技术检测CD4+T淋巴细胞在肿瘤抗原刺激下IFN-γ,IL-2分泌格局.结果 成功构建过表达Foxp3和A20 miRNA质粒,共转入DSL6A/C1细胞,成功筛选稳转细胞株,与阴性及空白对照组相比,Foxp3-A20修饰的大鼠胰腺癌DSL6A/C1细胞中Foxp3呈高表达,A20呈低表达,有统计学意义(P＜0.01).采用PEG成功构建多基因修饰的融合疫苗,多基因融合疫苗中Foxp3表达较未融合前有降低趋势.多基因修饰的融合细胞增殖、侵袭力较单基因修饰及未基因修饰相比明显增强,有统计学意义(P＜0.05).多基因修饰融合疫苗组CD8+T淋巴细胞对DSL6A/C1细胞株的杀伤活性随效应细胞增多而增强且优于单基因修饰组、未修饰组和对照组、0.9％氯化钠溶液组(P＜0.05).多基因修饰融合疫苗组能刺激CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2因子,与单基因修饰组、未修饰组及对照组、0.9％氯化钠溶液组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 过表达Foxp3及A20 miRNA修饰的肿瘤细胞与DC细胞构成的融合疫苗,对Treg的功能和数量有较好的抑制作用.体外水平检测多基因修饰的融合疫苗对肿瘤细胞的增殖、侵袭能力,对肿瘤细胞的杀伤性及细胞因子分泌能力均较较单基因、未基因修饰融合疫苗效果显著.多基因修饰融合疫苗可能为胰腺癌治疗提供新的治疗手段.