【摘 要】
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目的:构建大鼠TGFβ1基因RNA干扰慢病毒载体,并观测其对大鼠肝星状细胞HSC-T6的TGFβ1基因沉默效应与对Ⅰ型胶原(Col1a1)表达与分泌的影响.方法:针对大鼠TGFβ1基因CDs序列,筛选3个干扰靶点,合成其3对小干扰RAN(siRNA),将各对siRNA分别转入HSC-T6细胞,采用RT-PCR法从3对siRNA中筛选出最佳siRNA,设计并合成针对最佳siRNA靶序列的shRNA,
【机 构】
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第三军医大学西南医院中西医结合科 第三军医大学军事预防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国
【出 处】
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第二十六届全国中西医结合消化系统疾病学术会议
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目的:构建大鼠TGFβ1基因RNA干扰慢病毒载体,并观测其对大鼠肝星状细胞HSC-T6的TGFβ1基因沉默效应与对Ⅰ型胶原(Col1a1)表达与分泌的影响.
方法:针对大鼠TGFβ1基因CDs序列,筛选3个干扰靶点,合成其3对小干扰RAN(siRNA),将各对siRNA分别转入HSC-T6细胞,采用RT-PCR法从3对siRNA中筛选出最佳siRNA,设计并合成针对最佳siRNA靶序列的shRNA,退火形成双链,与载体pGreenPuro连接,构建pGreenPuro/TGFβ1shRNA慢病毒载体,予以酶切与测序鉴定.pGreenPuro/TGFβ 1shRNA慢病毒载体经293细胞包装,将包装产生的高感染力的慢病毒颗粒感染HSC-T6细胞,倒置显微镜观测经感染的HSC-T6细胞的GFP表达情况,在mRNA与蛋白水平检测重组慢病毒pGreenPuro/TGFβ1shRNA对HSC-T6细胞的TGFβ1基因的沉默效应及对Col1a1表达与分泌的影响.
结果:筛选到TGFβ1基因的最佳干扰靶序列.酶切与测序证实,成功构建pGreenPuro/TGFβ1shRNA慢病毒载体.该慢病毒载体能在mRNA与蛋白水平有效沉默HSC-T6细胞的TGFβ1,并抑制Col1a1的表达与分泌.
结论:成功构建大鼠TGFβ1基因RNA干扰慢病毒载体,该载体能有效沉默HSC-T6细胞的TGFβ1基因,并抑制Col1a1的表达与分泌.
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