【摘 要】
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目的 探讨ROS依赖性的p53活化在Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞早衰中的作用机制.方法 用低剂量Cr(Ⅵ)处理L-02肝细胞,SA-β-Gal染色检测早衰的发生；流式细胞术分析细胞周期；用氧化敏感型荧光探针CM-H2DCFDA在荧光显微镜下检测ROS水平；检测Cr(Ⅵ)诱导的早衰肝细胞中线粒体呼吸链复合体(MRCC)Ⅰ～Ⅴ活性；检测有或无抗氧化剂NAC预处理时Cr(Ⅵ)作用后肝细胞中p53 mRNA表达
【机 构】
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中南大学公共卫生学院卫生毒理学系,湖南长沙410078
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目的 探讨ROS依赖性的p53活化在Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞早衰中的作用机制.方法 用低剂量Cr(Ⅵ)处理L-02肝细胞,SA-β-Gal染色检测早衰的发生；流式细胞术分析细胞周期；用氧化敏感型荧光探针CM-H2DCFDA在荧光显微镜下检测ROS水平；检测Cr(Ⅵ)诱导的早衰肝细胞中线粒体呼吸链复合体(MRCC)Ⅰ～Ⅴ活性；检测有或无抗氧化剂NAC预处理时Cr(Ⅵ)作用后肝细胞中p53 mRNA表达水平、p53磷酸化蛋白水平以及衰老通路(p53-p21和Rb-p16)蛋白水平、肝细胞中促存活基因以及细胞周期S期相关蛋白表达水平；为证实是否ROS诱导早衰的功能依赖于p53,本研究用脂质体转染在肝细胞中敲除p53后检测Cr(Ⅵ)诱导肝细胞早衰发生以及衰老细胞百分比；检测p53敲除对Cr(Ⅵ)暴露后肝细胞中促存活基因以及细胞周期S期相关蛋白表达水平的影响.结果 低剂量长期Cr(Ⅵ)暴露引发L-02肝细胞发生早衰.早衰细胞出现明显的S期细胞周期阻滞,SA-β-Gal活性明显增高.早衰细胞中Cr(Ⅵ)选择性抑制MRCCⅠ和MRCC Ⅱ而诱导ROS的大量堆积.衰老细胞中磷酸化p53(ser 15)明显升高,p53被明显激活,NAC预处理明显降低了对照组和早衰细胞中p53水平,提示ROS可以对p53进行转录调控.对Cr(Ⅵ)诱导的早衰肝细胞中衰老通路的分析发现p53-p21通路,而不是Rb-p16通路参与了肝细胞早衰的过程.早衰细胞中ROS调节p53后进而调节促存活基因Bcl-2和Mcl-1的表达而抑制肝细胞的增殖能力,通过调节S期相关蛋白CDK2和Cyclin E进而诱导S期细胞周期阻滞.NAC预处理明显抑制了细胞早衰的发生.肝细胞中敲除p53后发现p53的缺失抑制早衰的发生.虽然Cr(Ⅵ)处理后的L-02-p53 shRNA细胞未发生早衰,但其ROS生成量仍明显增高,证实Cr(Ⅵ)诱导的L-02细胞发生早衰依赖于ROS,而ROS功能的发挥依赖于p53.结论 低剂量长期Cr(Ⅵ)暴露引发L-02肝细胞发生早衰,p53-p21通路参与早衰过程.Cr(Ⅵ)诱导产生的ROS通过调节促存活基因以及S期相关蛋白而诱导S期周期阻滞.敲除p53的肝细胞经Cr(Ⅵ)诱导后不发生早衰,提示早衰的发生依赖于ROS-p53功能.
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